这一时期塔里木盆地周围绿洲又增加了新的居民成分。匈奴、鲜卑、羌族、汉族及印欧语系的雅利安人、粟特人等都有迁入。公元五世纪初，焉耆一带曾被柔然人统治，公元552年，突厥军队击败柔然，建突厥汗国，天山南北皆在其统治之下。
晋·崔豹《古今注》记乌孙国有一种青田核，“得碧水则有酒味，出如醇美好酒……饮之尽随更注水，随尽随盛，不可久置，久置则苦不可饮。曰青田酒。”一位中原汉人得到过的两枚“青田核”。乌孙墓出土有陶制扁平茧形壶，装酒、水或奶，甚便于携带。此壶形制与陕西关中战国墓出土所见相仿。《魏书》记“悦般因在乌孙北……其先匈奴北单于之部落也……其人清洁朝俗，日三澡漱，然后饮食。国南界有大山，山傍石皆燋熔流地数千里乃凝坚，人取以为药，即石流黄也。
葡陶及葡陶酒亦殊著名。曹丕云其“味长汁多，除烦消渴。又酿以为酒，甘于曲蘖善醉而易醒，”（诏令）尼雅出土卢文续记用阴干葡陶代替经蜜做丸，至今沿用，“琐琐葡萄”即南方所称“番葡萄”，阴干后入药，解表透疹，利尿解毒，可治小儿麻疹、热淋涩痛、胎动不安等。甜瓜（哈密瓜）亦入药，《本草纲目》谓其“止渴除烦热，利小便，通三焦闭壅气，治口鼻疮。”籽、蒂亦入药。民间认为长吃甜瓜可长寿。
高昌王朝墓葬出土物有铜网眼罩、踢鞠球书、树叶锦丑衣（月经带）文书记述、牙签、耳勺等个人卫生用具。城中有陶质下水道及良好给水系统、护城河。文书中包括货屋人“不得病死”，痈创病人不得参与祭祀，以及病情报告、医治不安致死之调查等，可见医事制度一斑。户口账中记有“2人，医学生”，推测有医学馆之设立。
吐鲁番受中原文化影响甚大。除四书五经教授，“风俗、婚姻、丧葬与华夏小异而大同。”（《梁书·诸夷传》）所出土医药文书，有《唐人选方第二种》、《车草经集注》、《耆婆五脏论》、《诸医方髓》、《七名氏禁方第一仲》、《针灸节抄》、《牛病重药方》、《萎蕤丸服药方》（并药丸实物一枚）、《刘湄子鬼遗方》、《怀男怀女法》等多种残卷，今藏于德国、日本及新疆博物馆。特别是日本人掠去药价文书16种，记载了药物互市情况，中原药物及西方贩卖之香药，石蜜等均在此交易。一份文书记售香药2983斤，硇砂925斤，合瑜右、郁金根、石蜜等共4190斤，数量甚大。
公元前二世纪，佛教首先传入于阗，印度医药亦影响到新疆。印度医书有被译为于阗语，称《于阗语医学文献》，为斯文赫定、斯坦因掠去。唐天宝年间（八世纪）出现了一位名医赞巴希拉哈（生年不详），应藏王之邀入吐蕃，将印度医学和本地经验带到西藏。
1890年，Bowen氏在龟兹佛教塔发现七部古梵文著作，时代在公元前350年左右，包括医书三部。第一部论大蒜用途：长食可长寿；第二部名《精髓》（Naranitaka），记妙闻氏等古医家及处方；第三部为药物方剂。由此推测，当时涌入新疆之印度医书必不少。据《隋书·经籍志》所载录之《西域诸仙所集要方》、《西域婆罗仙人方》、《西域名医所集要方》等，可能是经新疆（西域）、医师所手辑、转译之医方，传于中土。
