幽门螺杆菌长期保存后染色体DNA酶切图谱的分析

幽门螺杆菌是近年来从人体胃组织中发现的一种细菌,与胃和胃溃疡的发生有密切关系,而空肠弯曲菌则是近十年来国内外学者较为注意的腹泻致病菌,这两种细菌营养要求及培养条件均较高,特别在菌株保存方面,至今还存在不少问题,为了更好地开展这些疾病的基础研究,我们对不同种类的弯曲菌,在20%小牛血清布氏肉汤和全羊血中保存,于不同时间检查了存活情况、生物学特性及染色体DNA的酶切图谱,实验证明,用这种方法保存,在存活率、菌体形态、生物特性保持较好,染色体DNA酶切带型前后保持一致。

1 材料和方法

1.1 菌株 幽门螺杆菌自各型胃病患者的胃粘膜中分离,共15株。空肠弯曲菌由国内不同地区分离,共34株(其中人源菌11株,鸡源菌8株,鸭源菌6株,鹅源菌4株、猪源菌2株、羊源菌3株),另外从比利时引进空肠弯曲菌3株(Cj22,32,26),结肠弯曲菌2株(Cc25,29)及海鸥弯曲菌3株(Cl34,35,36)和分子量测定用经过HindⅢ酶解的标准γ噬菌体DNA。

1.2培养基 试验用培养基用改良布氏琼脂及布氏肉汤均按参考文献配制。

1.3 染色体DNA提取 弯曲菌经37°C48h在混合气体(10%CO2,5%O2,85%N2)条件下培养,每个平皿20mlT.E洗菌,置30ml的离心管,经5000rpm/分离心10min,弃上清,沉淀用10mlT.E悬浮,加10%SDS1.5ml于65°C水浴中1h;用酚抽提3次,酚/氯仿异戊醇抽提5次以上,再用氯仿抽提2次;然后透析)T.Hp8.0)24h以上,换T.E4次,用玻棒缠绕经异丙醇沉淀的DNA,再用75%乙醇浸泡2次,每次10min,将坡棒倒插,DNA向上,室温中凉干;用800μlT.E将玻棒上的DNA洗入小离心管中,于-20°C中保存。

1.4 弯曲菌染色体DNA酶切 用PstⅠ,HindⅢ E.coRI,Bg1Ⅱ,XbaⅠ五种酶进行试验,各种酶均购自中国医学科学院基础医学研究所。

2 结果

2.1 过氧化氢酶阳性弯曲菌的生物学特性

对于-70°C条件下保存不同时间的弯曲菌主要生物学生物学特性:生长温度,1%甘氨酸的生长,对萘啶酮酸敏感性,尿素酶活必以及马尿酸水解,进行了检查与比较,基本特性与初分离时相同,其结果见表1。

表1 过氧化氢酶阳性弯曲菌经-70°C保存后生物学特性

菌株 生长温度 1%甘氨酸生长 对萘啶酮酸抗性 尿素酶试验 马尿酸水解
25℃ 37℃ 43℃
幽门螺杆菌 + + +
空肠弯曲菌 + + + +
结肠弯曲菌 + + +
海鸥弯曲菌 + + + +

以上结果表明在-70C条件下保存,弯曲菌复苏快,性状稳定。

2.2 弯曲菌于低温(-70°C)条件下存活检查

各种弯曲菌在布氏血琼脂中,经10代以目上传代稳定后,一般在混合气体条件下,于37°C经24h~48h培养后,均能见到较为丰富的生长,经涂片作0.3%复红单染色,镜检一般均能见到生长典型的弯曲菌,然后用Eppendorff离心管加1ml20%小牛血清布氏肉汤(或全羊血),将培养物用白金耳直接刮到小管内,形成浓厚的菌液,以后将小管在-20°C中预冻,次日再保存在-70°C中,经不同时间检查存活情况,结果如表2。可见在3~10个月内于-70°C条件下,全部存活,以上保存方法简便,易行,可作为弯曲菌保存。

表2 各种弯曲菌经-70°C低温保存后检查

菌株 存活情况 菌形检查
7D 15D 1月 2月 3月 6月 10月
人源株 11/11 11/11 11/11 11/11 11/11 11/11 11/11 典型海鸥翅样或弧形弯曲菌,极少数作球状
C.jejuni鸡 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8
空肠鸭 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6
弯曲菌鹅 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4
2/2 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2
3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3
H.pylori胃炎及幽门弯曲菌溃疡病患者 15/15 15/15 15/15 15/15 15/15 经分离传代可见40%~95%典型弯曲菌,有的作小球状
对照组 空肠弯曲菌 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 菌形较典型的弯曲状
结肠弯曲菌 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2 2/2
C.coli
海鸥弯曲菌 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3
C.laridis

2.3 经传代冷冻保存后,弯曲菌染色体DNA酶切图谱检测

2.3.1 空肠弯曲菌染色体DNA酶切 实验分两步进行 ①取空肠弯曲菌E3、E4(鹅源菌),G891(鸡源菌),流羊27(羊源菌)的染色体DNA,分别用三种内切酶进行消解(HindⅢ、PstⅠXbaⅠ)各管于37°C水浴中,作用1.5h,然后进行电泳,电泳在稳压下进行,电压为50V,电泳完毕后将琼脂糖凝胶(E.B加在凝胶中)置紫外灯下观察,并照像。②经初步试验后,又取适宜的PstⅠ进行消解,获得前后对比较好的结果。

2.3.2 幽门螺杆菌染色体DNA酶切 幽门螺杆菌自三种不同胃病患者的胃粘膜中分离,Cp397(慢性胃炎、溃疡病),Cp400(十二脂肠球溃疡),Cp407(浅表萎缩性胃炎),提取染色体DNA后,用Bg1Ⅱ进行酶解,各管于37°C水浴中,作用2.5h电泳40V.2h后30V17h,电泳后将琼脂糖凝胶(E.B加在凝胶中)置紫外灯下观察照像。可以看出用HindⅢPstⅠey XbaⅠ对不同弯曲菌酶切图谱有所不同,但其中以PstⅠ酶切的带型较清晰,还可看到四株不同来源的空肠弯曲菌及三株幽门螺杆菌,在较为长期保存后,染色体DNA酶切图谱带型完全一致。

3 讨论

弯曲菌菌种保存,对于深入开展对本菌的研究,有着非常重要的意义,文献上介绍的方法不多,幽门螺杆菌用全血或加20%小牛血清布氏汤或加入各种添加剂进行保存,但时间均不太长,Drum等用10%小牛血清布氏汤液体培养物,经24h培养后,添加50%甘油及小牛血清,于-70°C中能存活6个月;空肠弯曲菌用50%卵黄盐水,使用时,接种一白金耳菌苔,置微氧罐内,增殖24h,换上橡皮塞,置35°C温箱中,可保存5个月之久,在布氏肉汤内于-20°C中可存活2个月;15%甘油布氏肉汤中,在-70°C中可存活半年,但以上方法所保存的菌株,均不能获得完全存活;而我们所用的10%的小牛血清布氏肉汤,将24h~48h的新鲜菌苔,直接刮到保存的Eppendorff离心小管中,每管加培养基1ml,不需重新培养,可直接置-20°C中预冻,过夜后,再于-70°C中作长期保存,细菌染色体DNA限制性内切酶分析,可应用于流行病学调查及菌型的鉴定,同型的菌株应该有完全相同的染色体DNA酶谱;实验证明经这种方法对弯曲菌保存后、其生物学特性及染色体DNA酶切图谱的检查,均获得性状的前后一致,因此,这是一种比较简易可行的保藏方法,但对更为长期的保存,仍需作进一步的研究