聚合酶链反应检测胃粘膜中的幽门螺杆菌

已经证实幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是引起慢性B型胃炎的主要原因,在十二指肠溃疡病的发病机理中起重要作用,与胃癌的关系也越来越受到学者们的重视。诊断Hp感染的方法已有很多,其缺点是不够敏感,因此,需要一种快速、可靠,具有高度敏感性的检测方法。聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)用于检测Hp感染国外已有报道,国内也有人用此方法检测唾液中的Hp。本文报道了用PCR技术从胃粘膜活组织中检测Hp,并探讨该方法在Hp感染的诊断和在评价治疗后根除效果中的意义。

1 材料和方法

1.1 PCR方法的建立

1.1.1 细菌菌株和培养

Hp标准菌株NCTC11637.NCTC11848及空肠弯曲杆菌NCTC11351来自伦敦国家标准培养物收藏中心(National Collectionof Type Culture),由本院传染科保存并提供。50株Hp临床菌株来自因胃肠症状在本院行胃镜检查的病人,取胃窦活组织标本一块,匀浆后接种于含万古毒素10μg/ml,两性毒素B2μg/ml甲氧苄淀(TMP)5μg/ml的7%羊血琼脂培养基,于37℃微需氧条件培养3d~7d。根据菌落形态、革兰染色,以及尿素酶、过氧化氢酶、氧化酶试验阳性进行细菌鉴定。金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、不动杆菌、克雷白肺炎杆菌、伤寒杆菌、阴沟杆菌、弗氏痢疾杆菌及胎儿弯曲杆菌由本院临床药理研究所提供。

1.1.2 细菌DNA的提取

Hp菌种转种于含7%羊血的琼脂培养基,37℃微氧条件培养3d,非Hp菌种按常规方法转种培养24~48h后收获。以氯化苄方法提取细菌DNA,所用试剂按文献相应减少。于分光光度计上测定HpNCTC 11637 DNA 的OD260及OD280,计算DNA浓度。

1.1.3 引物的选择

CP1/P2引物来自Hp16SrRNA基因,参考Hoshiua等提供的序列,由中国科学院遗传所合成并纯化。CP1:5'—GCGCAATCAGCGTCAGGTAATG—3'CP2:5'—GCTAAGAGATCAGCCTATGTCC—3',扩增片段长度500bp。

1.1.4 PCR扩增Hp16SrRNA片段

采用50μl,扩增体系:10mmol/Ltris·HCI(Ph8.3);50mmol/LKCL;1.5MMOL/LgCI2;0.01%明胶;各200umol/LdATP、dcTP、dTTp、dGTP(Boehringer公司产品);各0.5μmcpl。CP2引物;1.25UTaqDNA聚合酶(中国科学院遗传所产品);1μl模板DNA。拉增反应在Perkin-Elmer公司的DNa Thermal Cycler480上进行:96℃5min,1个循环;94℃1min变性,55℃1min退火,72℃1.5min延伸,35个循环;最后于72℃继续延伸10min。反应中以HpNCTC11637做阳性对照,以去离子水代替模板DNA做阴性对照。扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2 PCR检测胃粘膜活组织标本中的Hp

96名因上胃肠症状行胃镜检查的病人及25名因Hp感染经抗生素根除治疗后复查胃镜的病人,于胃窦部取粘膜活组织,分别做尿素酶试验(兰州军医学校生产试剂盒),细菌培养及Warthin-Starry银染检查(由本科专职病理医师完成)。另取胃窦粘膜活组织村本一块,置500μlTE(10mmol/LTris.HCI.1mmol/LEDTA)(pH8.0)缓冲液中研碎,加10%SD30μl蛋白酶K(20mg/ml)3ml,55℃消化1h,以等体积苯酚—氯仿提取模板DNA用于PCR检测,标本处理程中以缓冲液做阴性对照。

统计学处理采用配对四格表资料的X2检验。

2 结果

2.1 PCR方法的敏感性

采用10倍系列稀释的HpNCTC 11637DNA检测PCR反应的敏感性。1μg~0.1pg的DNA扩增后在1%琼脂糖凝胶上均产生可见的条带,检出的最低Hp DNA量为0.1pg,相当于100个细菌细胞。

2.2 PCR的特异性

引物CP1/CP2对Hp标准菌株NCTC 11637、NCTC11848及50株临床分离的Hp菌株扩增后均可产生500bp预期片段,而对13株非Hp菌株,包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、不动杆菌、克雷白肺炎杆菌、伤寒杆菌、阴沟杆菌、弗氏痢疾杆菌、胎儿变曲杆菌及空肠变曲杆菌NCTC11351均呈阴性反应;对无Hp感染的人胃粘膜也呈阴性反应。

2.3 PCR与常规检测方法的比较

①PCR对初诊病人Hp感染的诊断:用PCR方示检测了96名因上胃肠症状前次行胃镜和胃粘膜活组织检查的病人,并与尿素酶试验、细菌培养和Warthin-Starry银染色等常规检测方法进行了比较(表1,2)。在四项检查方法中,PCR检出的阳性病人数最多,与尿素酶试验和细菌培养结果比较有显著性差异(P<0.05)。PCR方法还检出2例上述三项常规检方法均为阴性的Hp感染者。所有细菌培养或银染色阳性的病人,用PCR检测均呈阳性。②PCR对药的物治疗后Hp是否根除的评价:用PCR方法检测了25名十二指肠溃疡病伴Hp感染经不同抗生素方案治疗的病人,并与尿素酶试验,细菌培养及银染色方法比较(表3)。发现其中20名病人常规三项检测方法均为阴性,认为Hp已被根除,然而用PCR方法检测却发现在这20名所谓Hp已被根除的病人中有4例Hp仍为阳性,从而表明药物治疗并未使这4名病人感染的Hp彻底根除。对这4名病人中的3名于停药后5月~6月复查,发现2名病人尿素酶试验、细菌培养及银染色均转为阳性。证明PCR能检出治疗后用常规方法治能检出、而实际上仍然存在的少量Hp。

表1 胃粘膜活组织4种方法检测Hp的结果

PCR 尿素酶 细菌培养 银染色
阳性 阴性 阳性 阴性 阳性 阴性
阳性 58 7 56 9 63 2
阴性 1 30 31 31

表2 PCR与常规方法阳性检出率的比较

检测方法 n 阳性数 百分数(%)
PCR 96 65 67.7
尿素酶试验 96 59 61.5a
细菌培养 96 56 58.3a
银染色 96 63 65.6

aP<0.05,νsPCR

表3 十二指肠溃疡伴Hp感染治疗后检测结果

n 尿素酶试验 细菌培养 银染色 PCR
16
4
1
4

3 讨论

自从1983年Warren和Marshall报道从人胃粘膜中成功地分离出Hp以后,不少学者致力于Hp诊断的研究,旨在建立一种快速、简便,具有高度敏感性和特异性的诊断方法。当前,临床上应用最广泛的仍是通过胃镜取胃粘膜活组织做尿素酶试验、细菌培养及组织学染色(Warthin-Starry银染色)后做显微镜检查。尿素酶试验快速、简便,但常有假阳性和假阴性。细菌培养则要尽可能缩短接种前标本的转运时间,细菌生长缓慢且需要特殊的培养条件,球形Hp则不易培养成活。银染色后做显微镜检查虽然敏感性和特异性均高,但操作较烦琐,要求技术熟练程度高,且费时,价格较贵。非侵入性的方法如13C或14C呼气试验虽具有快速、可靠、无痛苦的优点,但费用较高,且接触同位素。血清抗体的检测则主要用于流行病学研究。作者的PCR方法与上述传统检测方法比较,不仅快速、简便,而且证实引物CP1/CP2对Hp的扩增是特异的,而对其它细菌和无Hp感染的人胃粘膜则无扩增产物出现。该方法只需从胃粘膜活检标本中粗提模板DNA,其检出的最小Hp DNA量为0.1pg,相当于100个细菌细胞,与文献报道结果相似。

本研究中将PCR技要用于Hp感染的诊断,并与传统的尿素酶试验、细菌培养及银染色方法进行了比较,9例细菌培养阴性及2例银染色阴性者,用PCR检测则全部为阳性。PCR与尿素酶试验及细菌培养的结果比较有显著性差异,而与银染色比较差异尚无显著性,可能由于受检样本数不够。以上结果表明,PCR技术确实较常规检测方法更为敏感,可以检出常规方法不能检出的Hp,是Hp感染的最敏感的方法。这与国外文献的结论一致。

本研究中将PCR技术用于抗生素治疗后检测Hp是否被根除,发现20例3项常规检测方法均为阴性认为Hp已被根除的患者,用PCR方法检测证实其中4例Hp仍为阳性。说明药物治疗并未使这4名病人感染的Hp彻底根除,只是细菌数量减少,用常规检查方法难以检出。对其中3名治疗后仅PCR呈阳性的病人的随访中证实,2名病人于停药后5个月和6个月时尿素酶试验、细菌培养及银染色均转为阳性,表明PCR用于评价药物治疗后Hp是否被根除,可以及早发现治疗不彻底,且在短期内感染可能复发的患者,从而指导继续药物治疗,防止同一株Hp感染的复发。