二、Hatch-Lee法(同时分离血浆脂蛋白方法)

1.试剂

0.5mol/LEDTA(pH8.0):186g EDTA-Na2加入去离水950ml,用NaOH调准pH值,再加水到1L。

溶液①(d=1.006):NaCl 11.40g,0.5ml0.5mol/L EDTA液,加去离子水1l,EDTA可抑制脂蛋白中脂质的氧化。

溶液②(d=1.182):NaBr24.98g溶于溶液①100ml中。

溶液③(d=1.478):NaBr78.32溶于溶液②100ml中。

0.15mol/LNaCl,0.3mlEDTA:8.77g NaCl、0.6ml的0.5mol/l EDTA(pH8.0),再加双蒸水到1L。

d=1.019液:1.851gKBr溶于溶液①100ml中。

d=1.063液:8.343gKBr溶于溶液①100ml中。

d=1.215液:33.496gKBr溶于溶液①100ml中。

以上溶液的密度,必要时用折射仪检测。

2.操作

取10mlEDTA Na2抗凝(1mg/ml)采血,离心(3000r/min)10min,分离得血浆。取血浆4ml加入容量10ml的超离心管中的底层,上面铺盖2ml溶液①(d=1.006)液,20kr/min(26kXg)离心30min(4℃),不用制动器让其旋转减速,以防飘浮物与下浮层相混;取出下层4ml混合血浆待用;超离心管中残留2ml,再取溶液①2ml沿管壁加入,仔细混匀分散脂蛋白,又加溶液①2ml铺在表面,20kr/min,4℃,离心1h,取出上层液直至变界处,此即CM组份。再将第一次离心所得的下层4ml混合血浆取出,其上铺2ml溶液①,40kr/min(100k×g),18℃离心17h,取上层1ml液,此即VLDL组份。再取出1ml至交界处,弃去,将管内剩余的4ml混合液移入另一超离心管内,取2ml溶液②(d=1.182)洗出离心管中残余的脂蛋白,加入到装4ml混合液超离心管内,混匀,40kr/min,18℃,离心21h,取出上层(d=1.062)1ml混合液,此即LDL组份。继续将中间层1ml除去,残存的4ml转入到另一超离心管内,用d=1.478(溶液③)2ml洗涤原管,尔后移入4ml残存液管内,仔细混匀,40kr/min,18℃,离心41h,上层(d=1.20)部分吸出,即HDL组份。下层为VHDL(very high density Lipoprotein)与其他血浆脂蛋白。LDL与HDL分别对0.15mol/lNaCl-0.3mmol/L EDTA(pH8.0)透析,4℃保存。