二、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

细菌转化的方法多以Mendel和Higa(1970)的发现为基础,其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌,使之进入感受态得以转化。

用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞,常用于成批制备感受态细菌。本法适用于大多数大肠杆菌菌株,且迅速、重复性好。操作过程简述如下。

1.从37℃培养16~20h的新鲜平板中挑取一个单菌落(如大肠杆菌DH52),或1ml新鲜的16~20h过夜培养物,转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约2~3h(旋转摇床200~300r/min),每隔20~30min测量OD600值≈0.4。

2.在无菌条件下将细菌转移到一个,用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中,在冰上放置10~20min。

3.于4℃用SorvallGS2转头(或与其离心管相配的转头)以4000r/min离心10min,以回收细胞。

4.倒数培养液,将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。

5.以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀,放于冰上。

6.于4℃用SorvallGS3转头(或与其相应的转头)以4000r/min离心10min,以回收细胞。

7.倒出培养液,将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。

8.每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定,此时,可以迅速将细胞分装成小份,液氮中冰冻,-70℃贮存备用。

9.用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中,每管加DNA或连接反应混合物(体积≤10μl,DNA≤50ng),轻轻旋转以混匀内容物,在冰中放置30min。

10.将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上,放置90s~2min,不要摇动试管。

11.快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1~2min。

12.每离心管加800μlSOC培养基,用水浴将培养基加温到37℃,然后将管转移到37℃摇床上,温育45min使细菌复苏,并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。

13.将适当体积(每个90mm平板可达200μl)已转化的感受态细胞转移到含200mmol/l MgSO4和相应抗生素的SOB培养基上。

14.将平板置于室温至液体被吸收。

15.倒置平皿,于37℃培养,12~16h后可出现菌落。