第三节 磷脂测定(当前章节内容组合)

一、化学法(消化法)

1.原理

以有机混合试剂(无水乙醇、乙醇)抽提血清中磷脂,再用浓硫酸和过氯酸消化抽提液中的脂类和其他有机化合物,用硝酸盐与磷反应生成有色化合物,比色定量。本法可用组织细胞磷脂的抽提定量。

2.试剂组成

代号 种类 浓度 组成 贮2~8℃ 有效时间
R-1 抽提液 无水乙醇:乙醇=3:1
R-2 消化液 用1L密器,加水约500ml,置冷水中缓缓加浓硫酸280ml到水中,冷却后加过氯酸(70%,AR)65ml,混匀,加蒸馏水至1000ml
R-3 显色剂 钼酸铵(A.R)2.5g+无水醋酸钠8.2g,加蒸馏水溶解并稀释至1L,监用时取此液体9份加新配的VitC液(10%)1份,混合即可
R-4 参考液(贮存液)1mg/L 称干燥KH2PO(A.R)0.4393g,溶于蒸馏水中,转移至100ml的容量中,用蒸馏水加至刻度。 冷藏
R-5 参考应用液 0.04mg/ml 取贮存液2ml加至50ml容量中,加水至刻度 冷藏

3.操作

按图15-5操作。

4.计算

血清脂性磷浓度=ESA/EST×10(mg/dl)

血清磷脂(以卵磷脂计)=ESA/EST×10×0.3229(mmol/L)

血清磷脂测定(消化法)操作图*采用带塞玻璃试管

图15-5 血清磷脂测定(消化法)操作图*采用带塞玻璃试管

二、酶法

1.原理

磷脂酶D因特异性不高,能水解血清中卵磷脂,溶血卵磷脂和神经磷脂(三者占血清总磷脂的95%),释放出胆碱,胆碱在胆碱氧化酶作用下生成甜菜碱和H2O2,在过氧化物酶作用下,H2O2,4-氨基安替比林、酚发生反应生成红色醌亚胺化合物,其颜色深浅与这三种磷脂的含量成正比,在500nm波长下比色计算结果为:

2.试剂

(1)酶应用液(参考配方):每100mlTris-His缓冲液(50mmol/L,pH7.8)中含:

磷脂酶D 45U
胆碱氧化酶 100U
过氧化物酶 220U
4-氨基安替比林 12mg
20mg
CaCl2·2H2O 8mg
TritonX-100 0.2g

(2)标准液:纯卵磷脂,临用前配制,5mg/2.5ml蒸馏水(含TritonX-1000.5%)

3.操作

(1)标本采集:空腹12h抽静脉血,不抗凝,分离血清或抗凝血分离血浆。

(2)在3.0ml酶应用液中加入血清(浆)20μl,标准管加标准液20μl,空白管加水20μl,放置37℃水浴10min后,波长500nm,比色,空白管液调零。

4.计算

血清磷脂(mg/dl)=TA/SA×200

血清磷脂(mmol/L)=血清磷脂(mg/dl)×0.01292