一、基因工程的常用工具

(一)载体

载体(Vector)是把外源DNA(目的基因)导入宿主细胞,使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒(plasmid)、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒(粘粒)、病毒等。载体具有能自我复制;有可选择的,便于筛选、鉴定的遗传标记;有供外源DNA插入的位点;本身体积小等特征。

质粒存在于多种细菌,是染色体(核)以外的独立遗传因子,由双链环状DNA组成,几乎完全裸露,很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制,一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制,一个细胞可复制30-50个质粒,如果用氯霉素可阻止蛋白质合成,使质粒有效利用原料,复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多,常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因,如复制起动区(复制原点Ori),便于复制扩增;抗抗生素标记(抗氨芐青霉素Apr、抗四环素Tcr等)或大肠埃希菌部分乳糖操纵子(E.coli LacZ)等,便于基因重组体的筛选;基因发动子(乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等)和转录终止序列,便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点,即基因插入位点,又叫基因重组位点,基因克隆位点。

常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统;双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点,便于选择,灵活应用。

(二)工具酶

工具酶是基因重组技术不可缺少的工具。主要有限制性内切酶、连接酶、核酸聚合酶、逆转录酶、核酸酶等。

限制性内切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA内切酶之分,Ⅱ型能严格识别核酸序列,并在识别区内特定的核苷酸处切开DNA双链。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA内切酶。识别分四核苷酸和六核苷酸,其序列旋转对称。切口分开端和粘端,产生3′-OH和5′-P末端。内切酶品种多,使用时应注意温度、缓冲液用量(一般1μg DNA/2-5单位酶)等反应条件。

识别序列 切口
Alu Ⅰ …AGCT… …AG CT… 四核苷酸
…TCGA… …TC GA… 平端切口
Eco R1 …GAATTC… …G AATTC… 六核苷酸
…CTTAAG… …CTTAA G… 粘端切口

连接酶有T4噬菌体DNA连接酶、T4噬菌体RNA连接酶、大肠埃希菌DNA连接酶等。DNA连接酶可连接平端,也连接粘端。反应需有Mg2+和ATP存在,pH7.5-7.6。最适温度37℃,30℃以下活性明显下降,但考虑到被连接DNa 的稳定性和粘性末端的退火温度,一般平端连接用20-25℃,粘端连接用12℃左右。

聚合酶有DNA聚合酶(以DNA为模板合成DNA大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ,大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow大片段),T4或T7噬菌体DNA聚合酶等);RNA聚合酶(以DNA为模板合成RNA,T7或T3噬菌体RNA聚合酶);逆转录酶(以RNA为模板合成DNA,除RNA病毒中发现外,发现大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有逆转录活性)。

大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′,3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草杆菌酶作用产生的一个大片段,有5′→3′聚合酶和5′→3′外切酶活性,无3′→5′外切酶活性。可用于缺口翻译(Nick translation)法标记核酸,也可用于DNA序列测定,修补DNA链等。

核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等,可水解相应的DNA和RNA,核酸酶S1可降解单链DNA和RNA,用量增大也可降解双链核酸。它可用于切去ds-cDNA合成中产生的发夹环。

末端转移酶在Mg2+存在下,选择3′-OH端单链DNA为引物加成核苷酸,在Co2+存在下,选择3′-OH端双链DNA为引物加成核苷酸,形成多聚核苷酸尾。常用于核酸末端标记和核酸连接的互补多聚尾(连接器)。

碱性磷酸酶去除5′-P,可防止二分子DNA片段5′端P基团自身空间障碍,影响DNA分子之间的连接,一般用碱性磷酸酶处理载体DNA除去5′端P基团,在连接酶作用下目的基因的5′端P先与载体3′端OH连接,再通过复制修复另一条链,使二条链完全连接。该方法大大提高了连接效率(图18-1)。

经碱性磷酸酶处理后载体DNA与目的基因DNA的连接

图18-1 经碱性磷酸酶处理后载体DNA与目的基因DNA的连接