三、核酸限制性片段长度多态性(RFLP)分析

RFLP分析是限制性内切酶、核酸电泳、印迹(blot)技术、探针-杂交技术的综合应用,多用于临床遗传性疾病的基因诊断。基本原理是遗传性疾病多有基因的缺陷,如基因缺失、基因插入、编码区小范围核苷酸序列改变或点突变等。前二者可将纯化的正常人和病人DNA同时用限制性内切酶切成片段,经电泳分离、印迹、探针杂交等找到目的基因。由于患者基因的缺失或插入,造成被限制性内切酶切开的片段(分子量)大小与正常人发生差异(限制性片段长度多态),使其电泳迁移率发生差异,而达到基因诊断的目的。小区域或点突变,可选用一个限制性内切酶的切点正好在这一变异位置,使切割作用和正常人发生差异(如正常人基因可切断而患者不能,或反之),达到诊断目的。现在PCR产物经变性为DNA单链,用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,只要有一个核苷酸发生变异,其电泳迁移率就会改变,进行多态分析(PCR-SSCP)。实际上把基因的异常位置设计在PCR扩增区域内,就能进行多态分析。(图18-8)

核酸纯化→内切酶作用→电泳分离→Southern blot→探针-杂交→显影,显色

点突变Eco R1RFL

图18-8 点突变Eco R1RFL