冻干皮上划痕用鼠疫活菌苗制造及检定规程

本品系采用鼠疫菌弱毒菌株,经培育后冻干制成。用于预防鼠疫。

1 菌种

1.1 菌种来源

用弱毒的EV菌株,由中国药品生物制品检定所分发或经同意。

1.2 菌种检定

冻干菌种在生产前每年需要检查一次培养特性、生化特性、噬菌体裂解试验及安全性。

1.2.1 培养特性

在琼脂平皿上,37℃培育44~48小时之菌落应为粗糙型,在肉汤中液面有薄菌膜,管底有沉淀物,肉汤透明。

1.2.2 生化特性

应分解葡萄糖,产酸不产气,石蕊牛乳轻度变红,在甘油培养基内不产酸不产气。

1.2.3 噬菌体裂解试验

将EV菌种涂于琼脂平皿上,加滴度为10-6以上的鼠疫噬菌体1滴,于28℃培育44~48小时,在噬菌体流过的地方应无本菌生长。

1.2.4 安全试验

用体重300~400g豚鼠3只,每只皮下注射120亿菌(28~30℃培育44~48小时的培养物)。在注射后第6天解剖1只,第21天解剖2只,检查注射部位、脾、肝、肺,并用脾、肝、肺及心血进行培育。其中心血和肺培育应无本菌生长。肉眼检查病变,注射部位可见充血,浸润变为脓疡,肝和脾可有丘疹状结节,肺部不应有鼠疫特异病变为安全试验合格。肺部如有显著病变时,应用同量豚鼠复试,若仍有显著病变时,菌种应废弃。

1.2.5 免疫力试验

用体得200~250g的豚鼠10只,每只皮下注射70万菌(28~30℃培育44~48小时的培养物)一次。于20~25天后进行攻击,每只皮下感染鼠疫强毒菌200个MLD。。同时用3组豚鼠作对照,每组3只,各组豚鼠皮下分别注射0.5、1及2个MLD的毒菌。免疫组及对照组至少观察25天。免疫动物存活不少于8只,而对照动物注射1个及2个MLD全部死亡时,免疫力试验为合格。

1.3 菌种保存

菌种应冻干保存,冻干菌种保存于2~8℃暗处。

2 菌苗制造

2.1 制造鼠疫活菌苗之实验室在生产期间应专用,不得作其他细菌工作,绝对禁止保存鼠疫毒菌。

2.2 制造用培养基

制造菌种可用pH6.8~ 7.2的厚氏琼脂培养基或其他适宜的培养基。

2.3 原液制造

2.3.1 第1代菌种

启开干燥菌种加入生理盐水溶解后,接种于厚氏琼脂培养基上,于28~30℃培育44~48小时为第1代。放2~8℃保存可使用半个月。

2.3.2 第2代菌种

用生理盐水将第1工菌种洗下,接种足够量的种子瓶,于28~30℃培育44~48小时为第2代,供大批生产用。不得用第3代菌种生产。

2.3.3 大量接种

第2代菌种经肉眼检查无杂菌后,加入适量生理盐水洗下菌苔,制成均匀的菌悬液,用此菌悬液接种培养瓶,于28~30℃培育44~48小时后,逐瓶肉眼检查,有杂菌者废弃。

2.3.4 采集

用由蔗糖、明胶、硫脲、味精及尿素组成的保护液洗下菌苔(洗菌前将凝固水倒去)或将菌苔刮入上述保护液内,制成原液。每瓶原液均应按《生物制品无菌试验规程》进行纯菌试验,不得有杂菌生长。

2.3.5 合并、稀释、分装

用4层纱布或绢布将纯菌试验合格之原液过滤合并,按中国细菌浊度标准比浊后用保护液稀释,使稀释后每人份含菌数7亿~9亿。然后按10或20人份分装于安瓿,并进行冻干。采集至冻干,原液不得超过7天,合并后的原液应按《生物制品无菌试验规程》进行纯菌试验。

2.4 菌苗分批

同一日培育的原液于同一次冷冻干燥者为1批。如1批有数瓶,应分亚批。

3 冻干

菌苗分装后应立即在-30℃以下进行冷冻。干燥时间可根据水含量及活菌数来决定。干燥完毕后进行真空封口,亦可充氮封口。

4 成品检定

4.1 物理性状检查

本品为白色或淡黄色疏松体。用真空测定器检查安瓿应为真空。菌苗水分含量不得超过3%。加入生理盐水后应在半分钟内溶解成均匀悬液。

4.2 浓度测定

菌苗经稀释后,按中国细菌浊度标准(7亿/ml)测定浓度。皮上划痕用菌苗每人份含菌数为7亿~9亿。

4.3 活菌数测定

由生产部门会同质量检定部门进行。每亚批取3支安瓿,加生理盐水溶解后,混匀比浊,稀释至10亿/ml。再按10倍系列稀释至10-6。用10-6稀释度悬液接种5个平皿,每个平皿接种0.1ml。涂匀后放28~30℃培育2~3天,计算活菌数。冻干后活菌率不少于45%为合格。如低于45%时可复试,如仍不合格则该批菌苗应废弃。

4.4 纯菌试验

每批菌苗按《生物制品无菌试验规程》进行。

5 菌落、菌形检查

应呈典型粗糙型菌落,涂片镜检,为革兰氏阴性杆菌。

4.6 安全试验

由生产部门会同质量检定部门进行。每亚批菌苗取2支安瓿,用生理盐水溶解后,用体重300~400g豚鼠2只,每只皮下注射120亿菌,第6天称豚鼠体重(不应比原体重减轻1/5以上)并取其中1只解剖,另1只观察到21天解剖。检查项目及要求均同1.2.4项。

4.7 免疫力试验

每10批菌苗抽检,10批以下者每3~5年至少检查1次。由生产部门会同质量检定部门进行。用体重250~300g豚鼠10只,每只皮下注射5000万菌,注射后20~25天以200个MLD的鼠疫毒菌进行皮下攻击。同时有3组豚鼠作对照,每组3只,分别于各组豚鼠皮下注射0.5、1和2个MLD。各组动物于注射后,观察25天。免疫动物活存不少于8只,而对照动物注射1个和2个MLD全部死亡时,免疫力试验为合格。

5 保存与效期

应保存于2~8℃暗处。自冻干后活菌数检定合格之日起效期为1年。