人血白蛋白多聚体含量及人血丙种球蛋白中lgG各组份测定(高压液相凝胶柱色谱法)

1 仪器

1.1 高压液相泵

1.2 高压液相色谱柱:TSKG3000SW(直径7.5mm,长60cm)。TSk Guard Column SW(直径7.5mm,长7.5cm)。

2 试剂

2.1 贮存液A:0.5mol /L NaH2PO4,pH4.8

称39g NaH2PQ4·2H2O,用超纯水溶解,并稀释至500ml。

2.2 贮存液B:0.5mol /L Na2HPO4

称179.1g Na2HPO4·12H2O,用超纯水溶解,并稀释至1000ml。

2.3 工作液C:0.2mol /L 磷酸盐缓冲液,Ph7.0(含1%异丙醇)

准确量取200ml贮存液A、420ml贮存液B、914.5ml超纯水、15.5ml异丙醇,混匀,用0.45μm水溶性膜过滤并超声脱气。

3 样品处理

用生理盐水将样品稀释至4mg/ml,然后用0.45μm水溶性膜过滤。

4 操作

用工作液C以0.6ml/分钟流速平衡高压液相系统至基线平稳。取处理过的样品25μl上柱,用工作液C以0.6ml/分钟流速洗脱,同时在紫外检测器280nm波长下记录色谱图及有关数据。记录数据的时间为60分钟。

5 计算

5.1 人血白蛋白多聚体含量计算

用高压液相系统的色谱工作站或积分仪对试验结果进行数据处理,算出多聚体相对面积百分含量。再根据转化公式换算成相对重量百分含量。

转化公式*X(%)=Y-1.6504/1.6359

其中X为凯氏定氮结果,Y为高压液相结果(如Y值小于1.6504,结果不用转化成重量百分含量,但在试验报告中需注明为相对面积百分含量)。

5.2 人血丙种球蛋白中IgG各组份相对含量计算。

5.2.1IgG各组份峰的划界。

图谱中各峰的界限为两峰间最低点到基线的垂直线。

5.2.2IgG各组份相对含量计算。

用高压液相系统的色谱工作站或积分仪对试验结果进行数据处理,算出各组份相对百分含量。

*应根据各单位使用的HPLC仪器及层析柱型号,经试验后得出转化公式。