冻干黄热活疫苗制造及检定规程

本品系用减毒的黄热病毒17D株接种鸡胚,经研磨、离心,取上清液冻干制成。专供进入或经过黄热流行地区的人员预防黄热之用。

1 毒种

1.1 毒种来源

减毒黄热病毒17D株。

1.2 毒种检定

1.2.1 无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

1.2.2 纯毒试验

用已知黄热病毒免疫血清做中和试验,证明其为黄热病毒。

1.2.3 猴体安全及效力试验

取冻干黄热17D毒种,加无菌生理盐水恢复其原液量,接种无黄热病毒中和抗体之恒河猴10只,每只脑内注射0.25ml(50000个小白鼠LD50)。注射后第2、4、6日各采血1次,分离血清,分别做10倍系列稀释。以原血清及10-1~10-3各稀释度的血清分别脑内注射体重10~12g小白鼠6只,每只0.03ml,观察21天,检查病毒量,LD50均不得超过Log2(4天以内死亡的小白鼠不计算在内)。猴子经注射后2~4周,再采血1次,分离血清,做中和抗体测定。10只猴中至少要有9只血清表现阳性中和反应。在1个月的观察期中,发现脑炎症状或因而死亡者不得超过1只猴。

1.3 毒种保存

原毒种和生产毒种批均应冻干后真空封口,保存于-70℃以下。

1.4 毒种传代和生产毒种的制备

取毒种3支,启开安瓿后立即以稀释液(不应含有任何人体蛋白和外源血清或抗体)溶化。待全部溶化后接种于7日龄鸡胚卵黄囊,每胚0.2ml。分2组进行,每组不得少于10胚,置37.5~38℃培育。70~80小时按组收取活存鸡胚,每组不得少于4胚。去眼后分组混合研磨,加稀释液做成悬液,经2000r/min离心10分钟,吸取上清液,在鸡胚中传代,并抽样按《生物制品无菌试验规程》进行无菌试验。按同法连续传递2代,传代时可不等无菌试验结果,第3代毒种的鸡胚收获后,吸取容器内液体做无菌试验(方法同上),并将鸡胚冻存于-40℃以下。将无菌试验阴性之鸡胚取出融化。按每胚加入1ml稀释液研磨,经2000r/min离心10分钟,吸取上清液,加入稀释液稀释5倍后置冰浴中待用。同时做毒力滴定。此代即为生产毒种。

2 疫苗制造

2.1 接种鸡胚

用7日龄鸡胚,每胚接种适当稀释度毒种液0.1~0.2ml于卵黄囊,接种后滴蜡封口。

2.2 培育

接种后37.5~38℃培育,70~80小时开始收获。

2.3 收获

收获时剔去死胚,分组收获活存鸡胚,去眼,装入大管中,逐管吸取管内液体做无菌试验,在操作过程中盛鸡胚之大管应置冰浴中保冷,收获完毕置-40℃冻存。

2.4 研磨、离心

2.4.1 研磨

剔除洒菌鸡胚,将冰冻鸡胚大管置冷水中融化,倒入研磨桶内,按每胚1ml加入灭菌双蒸水,用电动研磨机8000r/min研磨3分钟。

2.4.2 离心,收取上清液

将研磨后的鸡胚悬液以减压虹吸法分装于500ml瓶中,塞以胶塞,用2000r/min离心30分钟。离心应在2~5℃进行。

收取上清液,每批装一个球瓶,换以胶塞,保存在冰浴中。

2.5 半成品检定

2.5.1 无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行

2.5.2 冻干前病毒滴定

吸取球瓶中样品,作10倍系列稀释。取10-1~10-6之病毒液,每个稀释度用体重10~12g小白鼠6只,每只脑内注射0.03ml,接种部位忌用碘酒消毒,观察21天,计算LD50。

2.6 分装

疫苗保存在冰浴中进行分装,每安瓿分装量为0.5ml(10人份)。分装后将盛安瓿之金属盒放入-40~-50℃预冻2小时。

2.7 冻干

全部冻干过程为15~17小时,最后5小时升温20~25℃,最高不得超过25℃。冻干后安瓿真空封口。

3 成品检定

3.1 物理检查

外观为略带粉红色的疏松体,水分不应超过3%(g/g),加入稀释液应迅速溶解。

3.2无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

3.3 猴体安全及效力试验

方法及要求见1.2.3项,如生产毒种做过猴体安全及效力试验则疫苗可免做。

3.4 豚鼠安全试验

按原分装量加入生理盐水溶解疫苗,用体重300~500g豚鼠2只,试验前2~3天每天量体温、称体重。然后每只腹腔注射0.5ml,观察7天,每天量体温,应无病症发生。如2只豚鼠均有显著反应(体温超过40℃,体重减轻)或死亡,则该批疫苗应废弃;如有1只豚鼠有症症发生,可再用3只豚鼠重试,重试中如有2只以上豚鼠发病时,判为不合格,制品应废弃;如有1只发病,则再重试,仍有发病则判为不合格,制品应废弃。

3.5 病毒滴定

同半成品检定。每只小白鼠脑内注射0.03ml。病毒滴度应≥3.66LogLD50。

3.6 稳定性试验

由每批疫苗成品取3安瓿,置37℃2周,滴度下降不应超过1Log。

3.7 鉴别试验

每亚批成品应按1.2.2项进行鉴别试验。

3.8 稀释液

氯化钠注射液,其质量应符合《中国药典》规定。

4 保存与效期

应保存于-20℃,自干燥之日起效期为1年半,如保存于2~8℃,效期为6个月。