三、淋巴细胞亚群的测定及其在临床医学中的实用意义

淋巴细胞由于表面特异性抗原的差异可分为四大类（表10-3），这些不同抗原表现型的亚群执行不同的机能。而且某些疾病会选择性地损伤某些亚群而造成亚群之间的比例失调。根据FCM双荧光分析的结果，现将不同的抗原和不同的机能的淋巴细胞亚群列于表10-4。

表10-13 主要淋巴细胞亚群的表面抗原

＋：表现的抗原；－：未表现的抗原；＋／－：主要亚群有表现的抗原；－／＋：抗原仅表现于少数亚群。

表10－14　淋巴细胞机能性亚群

外周血白细胞的机能，特别是淋巴细胞的机能状态在一定程度上反应了机体的免疫机能。近几年来，用FCM来测定某些疾病的淋巴细胞及其亚群已成为重要的诊断和预后判断的指标，如对骨髓、器官移植，白血病、淋巴瘤的诊断和对免疫缺陷病的估价等。测定淋巴细胞亚群的主要依据是在于淋巴细胞表面不同的抗原表现型，而这些表现型又依赖于相应的单克隆抗体而被识别。所以，特异性很高的单克隆抗体结合先进的FCM，已为临床提供了不少非常有用而重要的资料，但被FCM所分析的淋巴细胞的整个临床意义尚未完全认识清楚。随着更多确定淋巴细胞表现型的试剂的应用，FCM对诊断和治疗计划的拟定以及预后的估计将会表现出更重要的实用意义。

1．T淋巴细胞亚群的测定如前所述，在使用FCM分析时，先用0^。散射和90^。光散射双指标将白细胞分为三群：淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。在二维点图上划出淋巴细胞群范围后，设立GFL的RFL单指标的直方图。命电子计算机仅计数所输入的淋巴细胞，即划线框出的那部分细胞。一般计数输入的细胞可设1000～5000个。直方图的分析可显示阳性细胞的百分率。应用输入细胞数、阳性细胞百分数以及白细胞分类计数，就能得到阳性细胞的绝对值，即每立方毫米血液中的绝对值。有时T淋巴细胞某亚群的绝对值比百分率更为重要，因为它可以表明T细胞某亚群的增高和减少。当然，淋巴细胞占白细胞的百分数也是一个重要数据，应当准确测出。

CD₄/CD₈细胞的比值，有时也用于反映病人淋巴系统的机能状态。不少临床免疫实验室已把CD₄/CD₈的值作为常规血检查的项目。在国际上，淋巴细胞亚群以及CD₄/CD₈并未建立统一数值，各实验室均需建立自己的标准。平均值一般为1.73～2.00。

一般而言，影响淋巴细胞亚群的因素较多，如年龄、性别、种族、以及外周围环境如季节　、药品等的影响。T细胞的绝对值在儿童略高于成人。婴儿CD₄细胞的百分率较成年人高；老年人的CD₈略低。正常人在一昼夜内也有周期性的波动：上午CD₄略低，下午4时之后开始增加，直至次晨，平均波动为15%～20%。尽管正常情况下淋巴细胞亚群有所变动，但仍属正常范围。某些疾病，如器官移植、免疫疾病、免疫抑制和一些淋巴细胞肿瘤，其淋巴细胞亚群及其比值测量结果均可能偏离正常范围。

有工作报道，传统的T辅助诱导细胞（CD₄⁺）具有抑制机能，而在T抑制细胞毒细胞（CD₄⁺）中，有些又具有协助的功能。因此，对原来设想的CD₄、CD₈的机能分群有所混淆。预计会有新的单克隆抗体再从CD₄和CD₈的细胞中分出。不过就目前看来，不少临床免疫实验室已用CD₄/CD₈比值结合淋巴细胞绝对值对多种疾病的诊断、治疗和预后的估计提供了不少有价值的资料。

2．艾滋病以及HLTV—III感染艾滋病是一种由人类T淋巴细胞病毒（HLTV--III）感染而造成的疾病。这种病毒主要侵袭CD₄⁺T细胞，而导致CD₄淋巴细胞减少，CD₄/CD₈淋巴细胞比值下降，甚至可低到0.5以下。艾滋病多发生在同性恋性行为活跃的男性，这可能与多次重复感染HLTV-III有关。对异性性行为活跃的人来讲，对HLTV—IIi 感染的机会也不容忽视。另一种感染的途径是HLTV血清阳性的献血者对受血者的感染。有部分人血液中T淋巴细胞减少，CD₄/CD₈比值下降，但HTLV血清反应不一定就是阳性。有些人CD₄减少不明显，但CD₈有所增加，也会导致CD₄/CD₈的的比值下降。

对可疑为艾滋病及血清检验为阳性的人，T细胞亚群是分析了解免疫系统被病毒破坏程度的标志。初诊时，CD₄细胞越少，CD₄/CD₈值越低者，预后越差。所以经治疗后恢复的指标则是CD₄细胞数增加，CD₄/CD₈比值升高。用荧光标记双染色的FCM分析的结果表明，艾滋病人除CD₄和CD₈的改变外，同时还可以表现出OKT₁₀阳性细胞增多（图10-15）。病人表现为CD₈和OKT₁₀同时增加时，预后比OKT₁₀阳性细胞低的病情严重。

图10-15　健康人艾滋病人淋巴细胞表面抗原的比较

艾滋病人Leu₃⁺、Leu₈^-和Leu₃⁺、Leu₈⁺细胞均减少，而Leu₂⁺、Leu₈^-细胞相应增加，

Leu₂⁺、Leu₇⁺与Leu2₃⁺、Leu₁₀⁺细胞明显增加

3．白血病和淋巴瘤的表现型近年来，为了弄清这些肿瘤的病理组织形态、影响治疗效果的原因与免疫状态的相互关系，对于不同类型的白血病和淋巴瘤作为广泛的细胞表面表现型的研究。

在诊断方面，FCM与单克隆抗体结合，可以弄清这些肿瘤的免疫起源，特别是分清B细胞性、T细胞性或骨髓性肿瘤。同时，还可以证实一些与细胞起源相关的抗原，如普通急性淋巴细胞性白血病抗原（CALLA、CD₁₀）。另外，可以用适当的试剂从反应免疫过程中来证实单克隆的肿瘤细胞的增殖。

大部分淋巴系统肿瘤均起源于B细胞。而B细胞肿瘤常用抗免疫球蛋白的抗体来证实。由于前B细胞与浆细胞表面均无免疫蛋白，所以用检测免疫球蛋白的办法就只能证实B细胞发育中间时期的肿瘤。目前，已有一系列的B细胞表面抗原被发现，而可以证实B细胞个体发育的各个时期的肿瘤。

对B细胞肿瘤最有价值的抗原是CALLA。这种抗原仅存在于B细胞正常以育期的前B细胞、早期B细胞以及80%～90%的急性淋巴细胞性白血病。因此，抗CALLA抗体可以区别淋巴细胞性和髓性白血病。用抗CALLA结合其它一些成熟B细胞的单克隆抗体，如CD₁₉，CD₂₀，CD₂₄（B₄，B₁，BA_-1）将能证实大部分B细胞来源的肿瘤。图10-16给出了B细胞分化的各个时期细胞膜的表现型。来源于B细胞的肿瘤和正常B细胞的表现型相似，也就是说，B细胞前身、成熟B细胞及最后分化为分泌B细胞—浆细胞。

图10-16　B细胞分化各时期的细胞膜表现型

由于T淋巴细胞来源的肿瘤浸润性较强，预后较差，并需要多种治疗。T细胞肿瘤的表现型千变万化，但大部分均表现T细胞抗原CD₇（Leu₉,3A）或其它T细胞抗原CD₂、CD₅（OKT₁₁，OKT₁）。这些抗原与肿瘤的细胞成熟时间有关，因而有助于拟定治疗方案。从FCM分析的结果表明，非成熟的T细胞肿瘤常表现非成熟的T细胞抗原，如CD₁和t₁₀。而成熟的T 细胞肿瘤则仅表现成熟T细胞抗原：CD₂、CD₃、CD₅和CD₇。有时也可表现CD₂、CD₈，但不会出现在同一个细胞上面。

由于肿瘤细胞的多种来源，很难避免在肿瘤标本中混杂正常细胞，这给FCM的分析带来技术上的困难。如残留的红细胞在FCM分析时，落入淋巴细胞框定的范围内而造成淋巴细胞各种亚群百分率下降。所以在制备标本时，应尽量想法去除红细胞。另一种污染是正常细胞存在于肿瘤细胞之间，这是一个很头痛的问题。例如骨髓常被外周血污染，反应性的正常淋巴细胞渗入到肿瘤组织中等，因此估计污染程度对解释FCM分析的资料有一定的意义。因为在FCM分析时，正常细胞与肿瘤细胞可能由于不同的体积和密度而被分开，根据对污染的估计，仔细分析图像就能得到比较正确的结果。

4．FCM对正常B细胞和B细胞肿瘤分析FCM对正常B细胞和B细胞肿瘤的分析在免疫学研究和临床诊断上有着重要的实用价值，B细胞的某些特征必须使用FCM来分析，但是这在FCM技术方法中仍存在着一些需要解决的问题。

（1）B细胞的标记：B细胞膜表现免疫球蛋白（SIg）存在于所有成熟B细胞。最早的B细胞前身，细胞质内含有免疫球蛋白M（IgM），但不存在于细胞膜表面。细胞质内IgM的证实以及同时测定细胞表面的SIg，对FCM是很困难的，当然今后可能会用双染法来解决这样的难题。大部分成熟B细胞具有SIgM和SIgD，少量具有SIgG和SIgA，当然这也可能是因为不同的亚群的缘故。但仅以Ig的重链来分类B细胞是不可靠的，因为B细胞可以从膜表面的IgM逐渐转变成IgG，因而从重链着手无法把B细胞分类。大部分B细胞肿瘤也表现出带有SIgM和SigD。随着B细胞逐渐转变成浆细胞，膜表面Ig 逐渐丧失，在细胞质内又出现大量的免疫球蛋白。

与重链相反，B细胞的整个发生期只有一种k或者λ轻链，B细胞肿瘤克隆仅表现一种轻链，因此通过在FCM上显示的不平衡的轻链表现可以确定B细胞肿瘤。测定方法见（3）。

用SIg的最大缺点是它的“嗜细胞性”，因为正常B细胞、自然杀伤细胞（NK）、激活T细胞以及所有巨噬细胞均有Fc段受体，因而可以不同程度地与抗SIg单克隆抗体的Fc段结合而产生非特异性的结果，因此选择抗体时，应使用已被胃蛋白酶消化过的、Fc段也被去除的、仅留下来的F（ab’）₂。

（2）FCM测定B细胞的临床指证：

①免疫缺陷；免疫缺陷可以是先天性或获得性的。低丙种球蛋白白血症和无丙种球蛋白白血症常伴有免疫球蛋白分泌的紊乱，因此有必要分析B细胞。

②淋巴瘤：非何杰金氏病的淋巴病，80%来源于B细胞。因而一旦怀疑为淋巴瘤，就应仔细用FCM对B细胞的表现型进行分析，可以分析血、骨髓、以及活检淋巴结等。首先确定肿瘤细胞的来源：B细胞性（CD₂₀⁺，SIg⁺）或T细胞性（CD₃⁺）。也有可能某些淋巴病来源于单核细胞（CD₁₁⁺）成裸细胞而表现出非T非B。一旦确立为B细胞来源后，就应更进一步分析克隆增殖的性质：单克隆、少克隆、或是多克降珠。单克隆性的增殖往往是肿瘤的标志。可以用SIg的轻链和重链分别加以测试，往往轻链比重链更有价值。在不久的将来，或许可以直接用免疫球蛋白的基本加以鉴别。

对B细胞亚群的确定，目前并未定论，但某些B细胞被CD₅（T₁，OKT₁）染色。正常B细胞中这些细胞较少，而多见于慢性淋巴性白血病和骨髓移植后的免疫缺陷时期。在B细胞的肿瘤病人中，10%的也可以出现CD₂₀（B₁）阴性反应，这是B细胞成熟而将分化为浆细胞的标志。在异常B细胞上，往往有一些B细胞的标记缺失或其它表现型出现，因而对异常B细胞的FCM的分析尤为重要。图10-17显示CD₁₉—FITc （B细胞）和CD₅-PE（T细胞）双染色的假三维图像分析。X轴为绿色荧光的Leu₁₂(B细胞)，Y轴为红色荧光的PE—Leu₁(T细胞)。从图中可见，有较多的细胞表现出Leu₁₂⁺tLeu₁⁺,阴性区内为NK细胞和红细胞等。

图10-17　异常B细胞双染色的假三维图

（3）k-λ测定B细胞克隆：k、λ测定法是一种从正常B细胞中测定少量B细胞克隆生长的方法。其基本原理是：若有B细胞克隆存在，将改变某一种轻链（k或λ）的荧光强度的分布。若轻链为k的B细胞生长，则抗k的抗体能测试出这种变化，而抗λ的抗体的测试没有任何改变。正常情况下，B细胞的k和λ的荧光强度分布是一致的（见图10-18）。

图10-18　k-λ克隆的测定

正常情况，B细胞轻链分布图像，一致κ和λ的波形没有区别。但在异常时，若有单克隆生长，κ链有分布则与λ不一致，在总和的曲线形态上也会产生差异。

在实际应用中，血液、体液、组织细胞的悬浮液效果均较好，而对于骨髓，大量细胞的非特异性标记会影响测定的结果。这里面必须强调，正常B细胞中的克隆细胞生长并不意味着它们必然是肿瘤细胞，还必须结合其它指标再做结论。不过这种方法对确定肿瘤细胞的存在、细胞发育阶段、以及经治疗后病情控制的状况等，都可以提供一些有用的资料。

以上仅限于从外周血的白细胞分析这一侧面介绍了FCM的某些疾病中的临床应用。其实，它也仅只是问题的一个部分。例如，有研究工作表明：CD₃₄抗原在由红系、巨核系、粒系和巨噬细胞三个细胞成株单元组成的成株细胞中有所表现。CD₃₄⁺细胞在人的骨髓细胞中约占1～4%，而在外周血中却探测不到。又如，NK细胞近来被认为可能和人类的某些疾病的发病机理有关，对NK细胞的测量可以作为免疫治疗的免疫监测的重要参数和有效的预后征状的指示。以前是用放射性的⁵¹Cr的释放来检测NK敏感的靶细胞的毒理学活性从而评估NK的功能的，而采用荧光探针CFDA（car－boxy—fluorescein diacetate）标记则可用FCM技术更为安全可靠地进行测定。有报告指出，健康男人的数值为（67.1±22.7%）%，健康女人为（63.9±20.0%）；患有妇科癌肿病人则为（38.5±23.1）%,明显偏低。这些工作表明，FCM的技术从免疫组织化学角度还会有所发展。在第二节　我们曾简单介绍了流式细胞分析技术在生物医学工程中应用的一些技术途径，这也可以启发我们借助于FCM来提高免疫组织化学的分析能力。可以预见，FCM一定会成为免疫组织化学的一项重要的技术工具，并将在医学科研和临床应用中发挥更大的作用。

附【美国Becton –Dickinson 公司可提供的FCM标准】荧光微球（Fluorescent beads）；鸡红细胞核（Chicken erythrocyte nu－clei）和小牛胸腺细胞核（Calf thymocyte nuclei），用于DNA测量的质量控制；单克隆抗体试剂；以及用于免疫表型（immunopheno－typing）和其它临床应用的药盒。