十一、辣根过氧化物酶标记核酸探针法

此法标记原理如下图所示:

辣根过氧化物酶标记核酸探针法

标记的HRP部分催化底物化学发光反应:氨基苯二甲酰肼氨基苯二甲酸

+N2+光→X-光片上感光10~20min显定影。

光亮子在酚、萘及胺类等增强剂促进下,而使光亮增强。

这种方法就是利用特殊的酶底物,氧化后把产生的能量转变为光能放出,称为化学发光。杂交后与探针结合的酶催化相应的发光剂,经增强剂将光能放大,在X光片上显示杂交信号。此方法灵敏度与同位素标记水平相当,简便快速,安全,是一种特异性好的检测手段,具有广泛的应用前景。

HBV-DNA的HRP标记方法:质粒中插入HBV全基因组DNA,长3.2kb,载体为PBR322质粒,4.3kb。将质粒DNA用三蒸水稀释成10ng/μl,取20μl放入EP管,100℃变性5min,加入20u HRP标记试剂,混匀,加入戊二醛20μl混匀,37℃10min,此时可立即使用,或放在冰浴中10~15min内使用,或加入50%去离子甘油-20℃保存供分子杂交用,可存放6个月。