十、反转录PCR方法检测RNA

RNA的多聚酶链式反应(RT-PCR)是以RNA为模板,联合逆转录反应(reverse transcrip-tion, RT)与PCR,可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的特异DNA,为RNA病毒检测提供了方便;并为获得与扩增特定的RNA互补的cDNA提供了一条极为有利和有效的途径。

RNA扩增包括两个步骤:①在单引物的介导下和逆转录酶的催化下,合成RNA的互补链cDNA;②加热后cDNA与RNA链解离,然后与另一引物退火,并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA,最后扩增靶DNA。

在RT-PCR中关键步骤是RNA的逆转录,cDNA的PCR与一般PCR条件一样。由于引物的高度选择性,细胞总RNA无需进行分级分离,即可直接用于RNA的PCR。但RT-PCR对RNA制品的要求极为严格,作为模板的RNA分子必须是完整的,并且不含DNA、蛋白质和其它杂质。RNA中即使含有极微量的DNA,经扩增后也会出现非特异性扩增;蛋白质未除净,与RNA结合后会影响逆转录和PCR;残存的RNase极易将膜板RNA降解掉。硫氰酸胍(GaSCN)-CsCl法或酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法可提得理想的RNA制品,尤以后者方法为佳,适合一般实验室进行。

常用的逆转录酶有两种,即禽类成髓细胞性白血病病毒(Avianmyeloblastosis virus, AMV)和莫洛尼鼠类白血病病毒(Moloney murineleukemia virus, MO-MLV)的逆转录酶(RT)。一般情况下用Mo-MLV-RT较多,但模板RNA的二级结构严重影响逆转录时,可改用AMV-RT,因后者最适温度为72℃,高于Mo-MLV-RT的最适温度(37℃),而较高的反应温度有助于消除RNA的二级结构。

一步法扩增(one step amplification)是为了检测低丰度mRNA的表达,利用同一种缓冲液,在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP直接进行mRNA反转录与PCR扩增。发现Taq酶不仅具有DNA多聚酶的作用,而且具有反转录酶活性,可利用其双重作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后的PCR扩增,从而使mRNA的PCR步骤更为简化,所需样品量减少到最低限度,临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA。该法还可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cD-NA的克隆,并有可能与Taq酶的测序技术相组合,使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在一个试管中进行。

最近Cetus公司推出rTth逆转录酶,兼具有DNA多聚酶的活性,对于RNA的发展起了很大的推动作用。有关rTth逆转录酶法参考第四节 有关内容。