二、细胞培养(Bhatl B和McGee JOD,1990)

1.完全培养基

RPMI76.0ml

胎牛血清 20.0ml

植物凝集素2.0ml

抗生素/抗菌素溶液(100×)1.0ml

L-谷氨酰胺(100×) 1.0ml

2.BudR(5’-Bromo-2-deoxyuridine,5’-溴-2-脱氧尿嘧啶)溶解10mg/ml BudR于dH2O中,0.2μm滤膜过滤除菌,分装后-20℃储存,BudR要在柔光(弱光)下操作。

3.胸腺嘧啶(Thymidine,Thd)按250μg/ml溶解于dH2O中,过滤后分装储存于-20℃。

4.Colcemid(Sigma)5.0μg/ml溶于dH2O中,过滤后分装储存于-20℃。

5.KCl(0.75mol/L)溶解560mg于100ml dH2O中,新鲜配制37℃保存。

6.固定剂甲醇冰醋酸按3:1(V/V)混合即可,现用现配,置冰上待用。

7.缺口平移试剂盒(Amersham和BRL公司)

8.生物素7-dATP(BRL)

9.糖原(BRL)

10.RNA酶A(Sigma)

(1)储备液

称取RNA酶A 1g溶于100ml醋酸钠中,置沸水中煮10min,分装后储于-20℃。

(2)工作液

用储备液按1:100稀释。

11.20×SSC

NaCl  175g

柠檬酸三钠 88g

dH2O1000ml

固定试剂溶解后,dH2O定容至1000ml,调pH至7.4,高压灭菌。

12.杂交液(高深度,HMmix)

去离子甲酰胺  6.0ml

100×Denhardt’s液1.0ml

50%硫酸葡聚糖 2.0ml

1%人或鲑精DNA20×SSC

※:临用前加入,终浓度为100~200μg/ml。

该液为高浓度杂交液, 存于4℃。

13.PBT液

BSA  5%

TristonX-100/(PBS) 0.1%

注:BSA液用前应用Whatman 3mm滤纸过滤。

14.兔抗生物素(α-生物素)单克隆抗体

用PBT液1:100稀释。

该单抗现可从英国Dako公司购得。

15.金(10~20nm)标羊抗兔二抗

用PBT液1:50稀释。

16.银溶液(Janesen)

17.Hoedst33258(Sigma)

储备液(100×)

Hoedst染料 5mg

甲醇  10ml

工作液:用2×SSC 1:100稀释储备液。