（一）病毒分离与鉴定
由肠道病毒引起的急性感染，用咽拭子、直肠拭子、粪便、体液及组织等标本接种单层细胞培养，很容易分离出病毒。在病毒症期不易分离出病毒。有中枢神经系统症状时，脑脊液分离阳性率10～85%。从胸腔、关节腔、心包液、脑脊液中分离出病毒有确诊的意义；从咽部分离出病毒有高度相关意义；而若从粪便中分离出肠道病毒，作解释时要非常小心，因为无症状排毒可达4个月以上。肠道病毒的鉴定是项既繁琐又费力的工作，主要依靠中和试验。
（二）血清抗体检测
多采用中和试验。一般单份血清抗体效价无意义，因为健康人血清中都有一定的效价。若取双份血清检测，抗体效价升高4倍可支持肠道病毒感染的诊断。
