第三节 肿瘤坏死因子的检测

一、生物学检测法

TNF的主要生物学活性之一就是对某些肿瘤细胞的细胞毒作用。根据这一特点,可利用TNF敏感的靶细胞测定TNF活性,根据细胞死亡得出TNF的相对活性。该法的关键是选择敏感特异的靶细胞。靶细胞可以是长期传代培养的细胞系,也可以是新鲜分离的原代细胞(如瘤细胞)。现以贴壁生长的L929细胞为例,简述TNF活性的检测原则。

两种TNF均可伤体外培养的L929细胞,细胞死亡率与TNF活性成正比。某些染料如中性红、结晶紫等能使活细胞染上相应颜色,再用脱色液将染料脱出,通过测定其吸亮度值间接监没细胞存活状态。

试验原则是收集对数生长期的L929细胞,用培养液调细胞至适当浓度,加入培养板小孔中,置37℃,5%CO2温箱中培养16~24h,换液后,在各孔中加入不同稀释度的待检样品,再加适当浓度的放线菌素D和适量培养液,继续温育16~24h,弃培养液,经Hanks液洗涤后,每孔加入适当浓度的结晶紫染色液,37℃培养1h,使活细胞充分着色。然后各孔加1%SDS短时温育使染色细胞溶解,再以酶标测定仪测各孔A570nm值。每次检测均设培养液(阴性)对照和不同浓度的rTNF(阴性)对照。以使阴性对照50%细胞溶解的标本最大稀释倍数为TNF活性单位,以u/ml表示。

由于放线菌素D能抑制DNA的合成、降低靶细胞对损伤的修复机制,因而在检测中加入放线素D可使靶细胞对TNF的敏感性增高10~200倍。

二、免疫学检测法

通常采用ELISA,该法特异性高、敏感性强且快速使捷,而且能够区别TNFα和TNFβ,为临床检测病人血清中TNF水平的有效方法,但不能反映TNF活性。

三、其它检测法

检测TNF还可用生物发光法及NAG微量酶反应比色法。这类方法是应用生化技术检测细胞内代谢的变化,从而推知靶细胞功能变化及死亡情况。其优点是不仅反映细胞的死亡情况,而且能反映细胞的功能变化。此外,还具有快速、方便、微量的特点。