第四节　细胞因子及其受体的检测(当前章节内容组合)

一、生物活性检测法

细胞因子生物学活性检测法是根据某些细胞因子特定的生物学活性，应用相应的指示系统和标准品来反映待测标本中某种细胞因子的活性水平，一般以活性单位来表示。生物学检测法一般敏感性较高，直接表示待测标本中的活性水平。但实验周期较长，如集落形成法需10～14；易受细胞培养中某些因素的影响，如血清、pH、药物；易受生物学活性相同或相近的其它细胞因子的影响，如检测IL-2时可受IL-4的干扰，TNF-α和TNF-β（淋巴毒素）表现出极为相似的生物学作用；易受待栓样品中某些细胞因子抑制物的干扰，如IL-1活性可被IL-1受体拮抗物（IL-1ra）所抑制，TNF-α可被TNF-BP所阻断；不能区分某些细胞因子的型和亚型，如IFN-α、β和γ，以及IFN-α中不同的亚型显示相同的生物学活性；某些指示细胞长期培养易发生突变；不同指示细胞对同一种细胞因子的敏感性不同，所慕名而来结果难于标准化；此外，某些人源的细胞因子如hIL-2对小鼠细胞起作用，但鼠源性的IL-2对人的细胞则无刺激作用。

生物学检测的方法大致可分为增殖或增殖抑制、集落形成、直接杀伤靶细胞、保护靶细胞免受病毒攻击、趋化作用以及抗体形成法等几类。

（一）增殖或增殖抑制法

其基本原理是应用某一细胞因子能特异地刺激或抑制某些指示细胞的增殖，通过³H-TbR掺入或MTT法显色，反映待检细胞因子的活性水平。

（二）集落形成法

其基本原理是应用骨髓干细胞体外半固体培养系统，根据不同造血因子能诱导干细胞或定向造血祖细胞形成某一种或某些种类细胞的集落，通过对形成集落形态学、酶学鉴定，计算不同种类集落形成的数量和比例，反映待测标本中CSF的种类和活性水平。

（三）直接杀伤靶细胞

在细胞因子中TNF-α、TNF-β具有直接杀伤某些肿瘤细胞的作用，采用TNF敏感的细胞株如小鼠成纤维细胞株L929，以及WEHI164亚克隆13作为指示细胞，通过³H-TdR释放法或染料染色等可检测待检样品中TNF的活性水平。

（四）保护靶细胞免受病毒的攻击

靶细胞受某些病毒感染后可发生明显病变和死亡，干扰素可保护靶细胞免受病毒的攻击，常用的病毒是水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV）,敏感的指示细胞为喉癌的上皮细胞株Hep2和羊膜的上皮细胞WISH，通过干扰素（IFN-α、IFN-β、IFN-γ）抑制病毒致病变的程度，计算出待测样品中IFN的活性单位。

（五）趋化作用

IL-8对多形核细胞、淋巴细胞具有趋化作用，可用小室法或软琼脂趋化法，PMN或淋巴细胞作为指示细胞，以细胞趋化的程度来反映样品中IL-8活性水平。

（六）抗体形成法

IL-6可在体外刺激某些B淋巴细胞系产生和分泌免疫球蛋白，常用的指示细胞有分泌IgG的ARH-77、CESS和分泌IgM的SKW6.CL-4。在一定的条件下，待检样品中IL-6水平与培养细胞上清IgG或IgM水平正相关，通过标准IL-6的对照可推算出待检样品中IL-6的活性。

表4-22　细胞因子生物学活性检测方法（举例）

续表1

续表2

二、免疫学检测法

免疫学检测法的基本原理是细胞因子（或受体）与相应的特异性抗体（单克隆抗体或多克隆抗体）结合，通过同位素、荧光或酶等标记技术加以放大和显示，从而定性或定量显示细胞因子（或受体）的水平。这类方法的优点是实验周期短，少受抑制物或相似生物池功能因子的干扰，如抗体的特异性高可区分不同型或亚型的细胞因子（如IFN），一次能检测大量标本，易标准化。与生物学活性检测方法相比，免疫学检测法在许多情况下敏感性低于前者，所得结果不表示生物学活性，有的McAb只能识别重组的细胞因子，在检测天然的细胞因子中受到限制。

免疫学检测的方法多采用ELISA和RIA法，可以分为平心法、竞争法和间接法。

（一）ELISA（或RIA）平心法

根据抗体性质和特异性不同可有以下几种不同的平心法ILISA。

1.PcAb与McAb夹心法　用纯化的多克隆抗体（PcAb）包被板子，加待检细胞因子（或可溶性受体）和标准品，上层加酶标记的McAb。有时为了增加敏感性，上层加McAb后再用酶标记第二抗体显色。

2.McAb与PcAb夹心法　用McAb包被板子，加待检样品，上层加酶标记的PcAb。有时为了增加敏感性，上层加PcAb后再用钊对PcAb的酶标记抗抗体。

3.双McAb夹心法 选择和应用识别同一个细胞因子（或受体）分子上不同表位的两种McAb，其中一种包被板子，另一种McAb标记酶。由于单克隆抗体亲和力识别表位地匀一，从质量控制角度来看，一般比上两种夹心法易控制。如目前已商品化检测细胞因子（或其受体）的检测盒大多采用双单克隆抗体夹心法。

4.细胞、McAb夹心法 用表达IL-2R的MT-1细胞包被板子，加入待检IL-2或标准品，上层加¹²⁵I标记的McAb，根据γ计数cpm值推算出待检IL-2含量。

（二）竞争法

有报道用况争法检测IL-2水平。用免抗IL-2PcAb包袱板子，同时加入¹²⁵I标记的IL-2和待测IL-2，根据γ计数cpm值得知待检IL-2对¹²⁵I-IL-2与PcAb竞争结合的程度，从而推算出待测标本IL-2的含量。这种方法检测IL-2的敏感性可达50pg/ml。

为了增加敏感性，在上述系统中可再连接上生物素，再用链霉亲和素（streptavidin）酶标记物进行放大。此外，还可用化学发光、改进显色底物等措施提高检测方法的敏感性。

表4-23 细胞因子生物学活性与免疫学检测方法的比较

三、胞浆或胞膜细胞因子（或受体）的检测

许多细胞因子产生过程中，有一个胞浆到胞膜，再释放到体液或培养上清中的动态变化。一般可采用免疫组织化学染色技术或免疫荧光技术检测细胞或组织切片中细胞因子（或受体）定位（胞浆、胞膜），产生细胞的频数，以及胞浆、胞膜、上清中浓度改变的动态变化。目前已报道IL-2、TNF-α、IFN-γ等细胞因子以及几科所有细胞因子的受体可用这类方法进行检测。流式细胞仪（FCM）与间接免疫荧光法相结合检测细胞膜表面细胞因子受体，可获得客观正确的结果。用同位素标记配体或标记抗细胞因子受体的抗体，进行竞争结合试验，可检测细胞因子受体表达的数量以及亲和力大小。

四、　核酸标记技术检测法

通过核酸标记技术可将细胞因子cDNA作为基因探钊检测细胞内细胞因子基因组DNA或mRNA。主要有以下几种方法：

1.应用同位素（或非同位素）标记的cDNA探针，检测经Northernblot后细胞因子mRNA水平或采用打点杂交法。

2.应用标记cDNA探钊与细胞或组织切片进行原位杂交，然后进行放射自显影。

3.细胞因子mRNA经反转录为cDNA，用特异性细胞因子引物经聚合酶链反应（PCR）扩增细胞因子cDNA,Southern blot后用标记探针检测特异细胞因子DNA水平。

（金伯泉）