(三)补体法

1.材料

(1)免疫血清60℃灭活20min,用Kolmers 盐水作2倍稀释成1:2,1:4,1:8……。补体用1:10稀释的新鲜豚鼠血清,抗补体荧光抗体等,按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价,如为1:32则免疫血清应作1:8稀释。

(2)补体用新鲜豚鼠血清一般作1:10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果,按2单位的比例,用Kolmers盐水稀释备用。Kolmers盐水配法:即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲盐水中,溶解MgSO4的含量为0.01%浓度。

(3)抗补体荧光抗体:在免疫血清效价为1:4,补体为2单位的条件下,用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价,然后按染色效价1:4的浓度用Kolmers盐水稀释备用。

2.方法步骤

(1)涂片或切片固定。

(2)吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液(此时免疫血清及补体又都稀释一倍)滴于切片上,37℃作用30min,置于保持一定湿度的染色盒内。

(3)用缓冲盐水洗2次,搅拌,每次5min,吸干标本周围水液。

(4)滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体30min,37℃,水洗同(3)。

(5)蒸馏水洗1min,缓冲甘油封固。

3.对照染色

(1)抗原对照。

(2)抗血清对照:用正常兔血清代替免疫血清。

(3)灭活补体对照:将补体经56℃30min处理后,按补体同样比例稀释,与免疫血清等量混合后,进行补体法染色。

本法之荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制,因而一种荧光抗体可作更广泛的应用,敏感性亦较间接法高,效价低的免疫血清亦可应用,节 省免疫血清,尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。