五、缺口平移法标记生物素DNA探针（二步法）

取HBV质粒DNA0.5μg,DNase I(SABC)2pg, 10×NBTμl，三蒸水补足体积至10μl，37℃，15min；加5mmol/l dATP dGTP dCTP Bio –11- dUTP各2μl，10×NBt 4μl，三蒸水补足体积至10μl,37℃，15min；三蒸水补足体积至49μl，DNA聚合酶i 5u，混匀，14℃过夜，加0.5mmol/l ED-TA(Ph8.0)1μl终止反应。

已标记探针的提纯：10mg/ml tRNA 2μl,10mmol/L Tris –HCl (pH7.5)150μl,2.5倍体积的95%乙醇，置液氮中15min或-20℃过夜。15000r/min，离心10min，真空干燥后，溶于适量三蒸水中，即为纯化的探针，-20℃备用。

使用闭环或线性双链质粒DNA，或分离的双链DNA片段均可进行此法标记，全质粒标记敏感性较高，因为标记物可同时掺入载体DNA。

此法也可用于放射性同位素和地辛标记DNA法。