一、DNA变性

DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂,双螺旋解开,形成单链无规则线团,因而发生性质改变(如粘度下降,沉降速度增加,浮力上升,紫外吸收增加等),称为DNA变性。加热、改变DNA溶液的pH、或受有机溶剂(如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等)等理化因素的影响,均可使DNA变性。

通常,可利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化追踪变性过程。因为DNA在260nm处有最大吸收值这一特征是由于含有碱基组成的缘故,在DNA双螺旋结构模型中碱基藏于内侧,变性时由于双螺旋解开,于是碱基外露,260nm紫外吸收值因而增加,这一现象称为增色效应(hyperchromic effect)。见图18-2。

DNA的增色反应

图18-2 DNA的增色反应

如果升高温度使DNA变性,以温度对紫外吸收作图,可得到一条曲线,称为溶解曲线(见图18-3),由图可见当温度升高到一定范围时,DNA溶液在260nm处的吸光度突然明显上升至最高值,随后即使温度继续升高,其吸光度也无明显变化。由此说明DNA变性是在一个很窄的温度范围内发生,增色效应是爆发式的。从而也说明当达到一定温度时,DNA双螺旋几乎是同时解开的。通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度(即熔解曲线中点对应的温度),由于这一现象和结晶的融解相类似,故又称融点或融解温度(melting temperature, Tm)。因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度。

DNA的Tm值

图18-3 DNA的Tm值

综上所述,Tm值和增色效应是目前描述DNA特性所常用的两个量。假定一个DNA大分子最初全部是双螺旋结构,在热变性后消光系数上升30%以上;如果DNA原先局部就处于单链状态(例如在分子末端),则变性后上升较少。增色效应的大小是DNA性质的一个简单指标,与分子量无关。Tm不是一个固定的数值,它与很多因素有关:pH、离子强度和DNA的碱基比例。随着溶剂内离子强度上升,Tm值也随着增大。在某一离子强度(~10-3M)以下,无需加热就使溶于其中的DNA出现不可逆变性。与A-T碱基配对比较,DNA双螺旋内的G-C配对更为牢固。在相同条件下,DNA内G-C配对含量高,其Tm值也高。

假定在一个双链DNA分子内某些片段含有较多G-C碱基对,根据它们局部Tm值差,用电子显微镜就可以观察和测量到这些片段,如在DNA某一片段内含有较多的A-T碱基对,在某一个温度时就可能出现双链解离的现象。但在同一温度下,含G-C对较多部分仍然保持双链结构。这是一种非常有用的技术。

DNA的Tm值与以下因素有关:

(1)DNA的均一性:均一DNA如病毒DNA,解链发生在很窄的范围内,而不均一的DNA如动物细胞NDA其Tm值的范围则较宽。

(2)DNA分子中(G+C)的含量:一定条件下DNA的Tm值,由G+C含量所决定,因为G+C之间有3个氢链,因此G+C含量较高的DNA,Tm值较高,二者的关系可用以下经验式表示:

%(G+C)=(Tm-63.0)×2.44

实验表明DNA分子中(G+C)克分子含量百分比的大小与Tm值的高低呈直线关系,见图18-4。

DNA和Tm值与G-C含量的关系

图18-4 DNA和Tm值与G-C含量的关系

(3)溶剂的性质:Tm不仅与DNA本身性质有关,而且与溶液的条件有关,通常溶液的离子强度较低时,Tm值较低,融点范围也较宽,离子强度增高时,Tm值长高,融点范围也变窄。因此,DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中,一般保存在1mol/l NaCl溶液中较稳定。