细胞的限制-修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶（methylase）来完成的。甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序。甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基化，保护DNA不被限制性内切酶切开。
真核生物中目前只发现5-甲基胞嘧啶（M5C）。M5C占整个胞嘧啶中的2～7%（果蝇和某些昆虫例外）。M5C大多以M5CpG的形式存在，不同物种或同一物种的不同组织中，M5C出现的频率也不尽相同。目前已经纯化作为商品出售的甲基化酶见表23-2。
将限制性内切酶和甲基化酶同时作用，可使有几种可能识别顺序的限制性内切酶只对其中一种识别顺序有效。例如限制性内切酶AvaⅠ的识别顺序是：
5’……CPyCGPuG……3’
3’……GPuGCPyC……5’
Py可以是任何一种嘧啶，pu可以是任何一种嘌呤。因此可以有4种识别顺序。如果同时使用甲基化酶TaqⅠ和甲基化酶HpaⅡ，则AvaⅠ的识别顺序将只是5’……CCCGAG……3’。现用图解说明（图23-1）。
如果有一个DNA片段，有AvaⅠ的3个识别顺序，当用AvaⅠ处理后可得4个片段。可是，如果先用TaqⅠ甲基化酶和HpaⅡ甲基化酶使DNA顺序中的有些碱基甲基化，然后再用AvaⅠ去切，结果只有1个识别顺序可被AvaⅠ作用，只产生2个DNA片段。
图23-1 几种限制性内切酶和甲基化的碱基
表23-2 甲基化酶及甲基化的碱基
| 甲基化酶名称 | 甲基化的碱基 |
| AluⅠ | 5’……AGC*T……3’ |
| BamHⅠ | 5’……GGATC*C……3’ |
| ClaⅠ | 5’……ATCGA*T……3’ |
| damⅠ | 5’……GA*TC……3’ |
| EcoRⅠ | 5’……GAA*TTC……3’ |
| HaeⅢ | 5’……GCC*C……3’ |
| HhaⅠ | 5’……GC*GC……3’ |
| HpaⅡ | 5’……CC*GC……3’ |
| HphⅠ | 5’……TC*ACC……3’ |
| MspⅠ | 5’……C*CGG……3’ |
| PstⅠ | 5’……CTGCA*C……3’ |
| TaqⅠ | 5’……TCGA*……3’ |
*表示甲基化
