四、ApoE基因型的检测

采用聚合酶链反应(PCR)限制性片段长度多态性(RFLP),即PCR-RFLP技术从基因水平检测ApoE基因多态性(基因型),操作简便、快速准确。

1.仪器与试剂

(1)仪器:电泳仪、基因扩增仪;

(2)试剂:Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA参考物(pBR322DNA/HacⅢmarkers)、HhaⅠ,其余试剂均为分析纯。

2.实验方法

(1)引物的设计与合成:引物参考文献设计,由Ranson Hill Bio Ssience Inc合成。序列为P1:5’-AACAACTGACCCCGGTGGCG-3’;P2:5’-ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC-3’。特异性扩增ApoE基因第4外显子区含编码112位与158位氨基酸的基因序列(如图19-5)。产物片段292bp。

PCR扩增产物经HhaⅠ酶切后RFLP模式

图19-5 PCR扩增产物经HhaⅠ酶切后RFLP模式

(2)模板DNA提取

①经典法,取全血100μl,蛋白酶K消化,按标准酚、氯仿、异戊醇法提取DNA;②碘化钠法,参照Loparev等法加以改良,取全血100μl加无菌双蒸水100μl混匀,加6mol/lNaⅠ200μl涡旋震荡30秒,加等体积氯仿/异戊醇(24:1),涡旋震荡30秒,离心后取上清加0.6体积异丙醇混匀,室温(或4℃)静置15min,离心后沉淀以37%异丙醇洗1次,晾干后溶于TE中。以上两法提取DNA经紫外分光光度计定量后,置-20℃保存备用;③微量血斑水煮法,取50μl全血点至无菌滤纸上,自然干燥后用甲醇固定,室温贮存。临用时,剪成一直径5mm的圆形血斑纸块,将其混至100μl无菌双蒸水中,100℃煮沸30min以裂解细胞。取混合物15μl作膜板用。

(3)PCR扩增;反应体系为50μl。其中含1×扩增缓冲液(Tris-HC167mmol,pH8.3;MgCl225mmol/L;KCl50mmol/L)5μl,1%二甲亚砜5μl,dNTP各200μmol/L(5μl),引物P1、P2各5μl(分别为0.5μmol/L,模板DNA200mg(5μl),双蒸水15μl,加石蜡油30μl,离心混匀,置热循环仪(PE2400型,Perkin Elmer Cetus)中95℃预变性12min后,再加入TaqDNA聚合酶2U(5μl),然后按下列程序循环35次,即94℃变性1min,65℃退火1min,72℃延伸1.5min,最后于72℃再延伸10min,取产物10μl经2%琼脂糖凝胶电泳(溴化乙啶),紫外灯下观察扩增为292bp。

(4)扩增产物的限制性酶切:PCR扩增产物17μl直接用10UHhaⅠ酶切,37℃消化4h。反应终止后产物经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,EB染色35min,以DNA片段长度标准物为参考,紫外灯下观察结果并照像。ApoE基因型判定参照Richard等方法加以简化,即ε2/2出现3条带(91bp,83bp,61bp),ε3/2出现5条带(91bp,83bp,61bp,48bp,35bp),ε3/3出现4条带(91bp,61bp,48bp,35bp),ε4/3出现5条带(91bp,83bp,61bp,48bp,35bp),(91bp,72bp,61bp,48bp,35bp),ε4/2出现6条带(91bp,83bp,72bp,61bp,48bp,35bp),ε4/4出现4条带(72bp,61bp,48bp,35bp)。

该法检测的ApoE基因型图谱如表19-2所示。表中所示动脉粥样硬化性脑梗死(ABI)。

表19-2 人ApoE基因型和等位基因频率分布(%)

组别 例数 ApoE基因型频率 ApoE等位基因频率
ε2/2 ε3/2 ε4/2 ε3/3 ε4/3 ε4/4 ε2 ε3 ε4
对照组 113 16.8 1.8 69.0 11.5 0.9 9.3 83.2 7.5
ABI 50 16.0 2.0 50.0 30.0** 2.0 9.0 73.0* 18.0**

*:P<0.05;**P<0.01(均与对照组比较)

病人ε4/3基因型频率(30.0%)与ε4等位基因频率(18.0%)均显著高于健康对照组。