第一节 胆固醇测定(当前章节内容组合)

一、Abell-Kendall改良法

1.原理

血清加入醇溶性氢氧化钾,使胆固醇从脂蛋白中分离出来,同时使胆固醇酯加水分解成游离胆固醇,加石油醚振摇、抽提,使胆固醇移入石油醚层,分离并取一定量的石油醚层,蒸发至干,再进行Liebermann-Burchard 显色反应,620nm比色定量。该法可用于基本功训练及组织细胞胆固醇的提取定量。

2.试剂组成

代号 种类 浓度 组 成 贮存2~8℃ 有效时间
R1 乙醇 优质纯
R2 石油醚 沸点68℃,特级纯
R3 水醋酸 分析纯
R4 无水醋酸 胆固醇分析用,不含HCI
R5 浓硫酸 分析纯
R6 KOH液 33%(W/W) KOH10g+H2O20ml
R7 乙醇性KOH液 R194ml+R66ml 临用前配制
R8 Liebermann 配制后
Burchard R420体积+R51体积+R310体积 1h
试剂* 内用完
R9 胆固醇标准液 5.17mmol/L 胆固醇标准品200mg+R1→100ml

*:在三角烧瓶内,加入无水醋酸,于冰水中冷至10℃以下,再慢慢加入浓硫酸,混合,静置10min,又加冰醋酸混匀,备用。

3.操作

血清胆固醇(Abell法)测定操作图

图15-1 血清胆固醇(Abell法)测定操作图

按图15-1操作。

4.计算

标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)

二、酶法(CEH、COD-POD法)

首先将血清中胆固醇酯在胆固醇酯酶(CEH)水解为游离胆固醇和脂肪酸,胆固醇在胆固醇氧化酶(COD)作用下,生成△4-胆甾烯酮和H2O2,再H2O2经过氧化物酶(POD)作用在4-氨基安替比林(4-AA-P)及N-乙基-N-(3-磺基醋酸)-3甲氧基苯胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS)参与下,生成红色醌亚胺色素。

H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林→红色醌亚胺色素

(一)手工测定法

1.试剂组成

代号 种类 浓度 组成 贮2~8℃ 有效时间
Na2HPO4 50mmol/L
Na2H2PO4 50mmol/L
胆酸钠 3mmol/L
4-氨基安替比林 0.82mmol/L
R1* ESPAS 14mmol/L 24h
Carbowax-6000 0.17mmol/L
CEH 33U/L
COD 117U/L
POD 6700U/L
R2 标准液 5.17mmol/L 用异丙醇溶解胆固醇

*混匀,调pH至6.70±0.10(25℃),或购买试剂盒。酶以活性单位表示。

2.操作

按图15-2操作。

3.计算

标准总胆固醇浓度=ESA/EST×5.17(mmol/L)

(二)自动化分析仪测定

以CL-7200型全自动生化分析仪检测为例。

1.试剂组成

A液:CEH、POD、抗坏血酸氧化酶等。

B液:COD、4-氨基安替比林等。

血清胆固醇测定(酶法)操作图

图15-2 血清胆固醇测定(酶法)操作图

2.上机参数

项 目 参 数
方 法 终点法
波 长 双波长(540nm,700nm)
反应温度 37℃
试剂A反应时间 2~3min
试剂B反应时间 5~6min
样本用量 3μl
试剂A用量 250μl
试剂B用量 120μl
单位 mmol/L

3.操作过程

自动化分析仪测定操作过程

4.计算

以△A=A2-A1,根据同样处理之标准或质控物计算,打印结果。

5.注意事项

(1)试剂与样本量可根据分析仪要求按比例改变。

(2)试剂在有效内2~8℃避光食保存。

(3)胆固醇含量超过200mmol/L,需用生理盐水稀释再测。