3 讨论

3.1 Hp的生物学地位虽然Hp引起的世界性关注及人们对其广泛研究是在1983年以后,但早在1847年Bottcher已在人胃中发现了螺形的细菌,随后人们又从许多动物-狗、大鼠、猫的胃中发现类似细菌。1906年又从溃疡性胃癌病人的胃内容物中找到这类细菌。其他一些报告证实在健康人中不易发现它们。1939年 Doenges在242例人胃尸检的染色标本中发现有43%存在数种不同类型的螺形菌,但不明确这些菌与各种胃病间的相互关系。1954年Palmer在1000例胃活检标本中未能证实上述报告,认为前人发现地螺形菌系吞入或死后污染所致。1975年Steer和Colin-Jones报告了胃溃疡病人胃粘膜上出现细菌,经分离培养,结果是绿脓杆菌。后人仔细观察该文图片,认为胃粘膜上的细菌是一种与绿脓杆菌无关的螺形菌。在同一时期,许多学者发现多种动物胃中存在有内源性尿素酶活性。最早是1924年有Luck和Seth描述的,后在1955年Korngerg和Davies的综述中断定胃的尿素酶主要存在于胃体部,且是细菌源性的。在人类胃的研究中证实了这种酶的存在与溃疡病之间的关系,有些病人还成功地利用了尿素进行了治疗。

1983年Warren从慢性活动性胃炎活检标本的胃粘膜上皮表面发现了一种未经鉴定的弯曲状细菌,Marshall又用弯曲菌属的分离培养技术从幽门的活检标本中分离培养成功了该菌。由此,曾先后命名为GCLOs和Hp。1984年Langenberg并发现原先认为的胃中内源性尿素酶即由此菌产生。因此在1984年以前人们对Hp的生物学性状了解得比较少,只知它在光镜下呈螺形,分离培养需微氧条件,与弯曲菌属的代表菌种-空肠弯曲菌相似,只是它有较强的尿素酶活性与空肠弯曲菌不同。此后这种细菌与各种慢性胃病间的密切相关性为世界各地的学者所进一步证实。由此掀起了一股对Hp研究的热潮。

在国内,我们对Hp表型特征—生物学性状的系统研究是比较早的,其结果已如前述。根据这些结果,Hp确实与弯曲菌属的代表菌种——CJ有一些共同或相近之处,例如光镜下的形态相似,都需要微氧的条件分离培养,营养要求大致接近。培养的最适温度虽有差别,但都能在37°C生长,都能产生触酶、氧化酶,均不能利用糖类,能产生微量的H2S。对各种抗生素的敏感谱与CJ相比,绝对值虽有一些出入,但总趋势大致相仿。Hp的DNAG+Cmol%与CJ基本相同,甚至重叠在同一范围内。从这些特征,Hp与CJ同归一属似乎无可置疑。

俟后,进一步的研究发现Hp与CJ间存在着更多的本质上差别:①有一些重要的生化反应与CJ明显不同,例如尿素DNA酶,碱性磷酸酶、亮氨酰胺酞酶等,Hp均为阳性,而CJ/CC均为阴性,这与国外文献报道是一致的。②更重要的是在超微结构上Hp与CJ/CC存在着不同,特别是鞭毛、鞭毛的根部和菌体末端的外形其内侧具有“极膜”,曾提出它可能与水螺菌(Aquaspirillum,AS)同属。但不久发现AS为双极丛毛菌,一般每端只有1~2根鞭毛,Hp虽偶也可见双极鞭毛,但多数情况下只有一端有鞭毛,且为有鞘鞭毛,数量多到6根。更重要的原因是因为AS的DNAG+Cmol%为49~66,与Hp相关甚大。很快就不再有人提及。③从所测的Hp菌体脂肪酸组成来看,Hp与CJ/CC之间亦存在着明显差别,它们的主峰是各不相同的,这一特征与国外文献报道基本一致,只是我们Hp的几个主峰间的相对值与国外报道者略有上下,推测可能是地方菌株之间的差异。④按菌体蛋白电泳的主要蛋白条带,Hp与弯曲菌属的主要代表菌种之间亦存在明显的不同,Hp有7条主要条带,CJ/CC仅有3条,其中只有分子量为63000与89100的2个条带基本相同。⑤根据Hp耐热抗原与CJ的Penner分型血清的交叉反应,它们之间亦不存在有明显的交叉抗原,其中有一个值得讨论的问题是由CJ22052菌株免疫得的Penner45型血清与28株Hp菌之间有18株发生明显交叉反应。我们深感这一现象奇特,特地对22052菌株作了深入一步的研究,发现它在基本生物学性状方面确实与CJ类似,但在电镜下其菌体末端及鞭毛的特征与C明所不同。更重要的是DNA G+Cmol%仅有27.8,明显地超越弯曲菌属范围。因此,若22052菌株不属于弯曲菌属,则Hp与CJ之间基本上不存在耐热抗原的交叉。至于Hp85067菌株与的Penner26,34,35型血清之间的交叉凝集原因未明,有待进一步作出解释。

表8 Hp与CJ/CC.CF菌体末端扩鞭毛的超微结构比较

菌种 菌体末端 鞭毛特征 鞭毛根部特征
外形* 顶端 内侧 数量*鞘
吸盘样凹陷 电子密度降低区
CP 纯圆 - + 2~6 + 末端球形或脱鞘状 每一鞭毛在菌体细胞膜上有一圆球状根基
CJ/CC 圆锥状 +* - 1 - 鞭毛从吸盘样凹陷中央伸出未见圆球状根基
CF 稍钝圆 + + 1 - 同CJ/CC

*国外文献中亦有同样报道,其他特征尚未见文献报道。

综上所述,从Hp的各方面的表型特征来看,Hp与弯曲菌属的代表菌各:CJ22052菌株菌体末端超微结构(×60000)-CJ、CC之间,差异性多于共同性,且其差异点比共同点更具有本质性。因此,我们赞同国外个别学者提出的Hp不归入弯曲菌属,而宜另立一个新属的主张。

至于Hp究竟应归入哪属细菌,Romaniuk从分析Hp,多种弯曲菌属细菌和产琥珀酸沃林菌(Wolinellasuccinogenes,WS)等的16s rRNA核苷酸序列得出结论,认为Hp与弯曲菌属关系较远,而与WS关系较近,似乎应与WS同归一属。但Hudson则认为Hp在DNAG+Vmol%(36%~38%对46%~49%),脂肪酸组成,极性脂质(polar lipid),总蛋白电泳谱和它同时具有MK-6及TPQ-6方面与WS不同,因此不宜归入沃林氏属,他认为根据Hp的培养和形态的基本特征仍应归入弯曲菌属为宜。遗憾的是迄今还没有一个比较统一的能够应用于所有细菌的细菌学命名原则,因此对有一些难于命名的细菌免不了会引起一些争论。虽然现在对有一些细菌的研究已经开始迈入了分子遗传学的领域,但是当前以表现型特征作为分类的主要依据仍然无可置辩地具有更现实的意义。虽然几乎收集了当今世界上弯曲菌属所有的15种菌种,甚至包括Hp和WS,进行了16s r RNA核苷酸顺序的分析 。根据同源性的程度不同将它们分成三群,可是他不得不承认由于缺少对弯曲菌属各种菌种表现型特征的全面了解和也由于没有将所有的细菌都用同样的试验和同样的方法比较过,因此难于对三群细菌作出适当的专门的描述。Good-win认为由于Hp在临床上的重要性,急需把它命名学地位及早地确定下来,他对Hp、WS和弯曲菌属细菌作了超微结构和形态、菌体脂肪酸组成、甲苯醌、生长特征和酶的活力五个方面的表现型特征作了研究,他的结论是Hp不应归入沃林菌属,他提出给它命名为Helicobacter pylori(暂译为幽门螺杆菌)。我们的意见偏向于赞同他的意见,因为我们亦对一部分细菌作了系统的表现型特征的研究,除了甲苯醌我们没有做以外,我们还做了DNA G+Cmol%,菌体蛋白蛋电泳分析和与CJ的Penner分型血清之间交叉反应的研究,大部分结果都表明,Hp与CJ之间有明显的不同。

3.2 Hp的致病性自从Warren和Marshall发现Hp后,世界各地学者相继从各种慢性胃病及十二指肠溃疡病人的活检标本中找到了Hp,且检出率都很高,从而初步确定了Hp与各种慢性胃病的密切相关性。1985年Marshall按照Koch的病原体致病性原则,吞服了Hp菌液作了自身感染实验。二位学者先后都找到了Hp在自身引起急、慢性胃炎的证据。1987年Krakowka又以悉生小猪(Gnotobioticpiglet)口饲Hp菌液液造成Hp感染的动物模型。至此,Hp直接或间接与各种慢性胃病有关已得到大多数学者的认可。但Hp的致病物质和致病机制,迄今尚未阐明。我们从超微结构研究中发现了一些在国内外文献中尚未作报道的现象,并结合光镜下的观察所见和一些有关文献,对Hp的致病机制或致病过程作出如下推断。

胃是人们对摄入的食物彻底消化前进行预处理的重要器官。在预处理过程中,伪造胃壁肌肉收缩和舒张的物理和机械作用使食物在胃中受到胃酸和胃蛋白酶的强烈化学作用而得到初步消化。本来胃的这种强力的缩舒运动及强酸,酶类作用对胃壁本身就可能造成损伤作用,但由于在胃壁粘膜表面有一层较厚的、且在不断代谢更新的不溶性粘液连续层存在,且在其表面尚有可溶性粘液层起着滋润作用,因而保护了胃粘膜。为何经口入胃的过路细菌很多,而独有Hp能透过不溶性粘液层定居于胃粘膜上皮表面?为何Hp对人胃的感染率这么高,而在不溶性粘液层下胃粘膜上皮表面几乎找不到有第二种细菌的大量存在?为何一个人一旦被Hp感染后,Hp能长期在胃中持续存在?为何用有效抗生素治疗常不能彻底杀灭胃粘膜上的Hp?所有这些问题都说明Hp的感染有其独特性。根据我们所观察到的Hp与胃粘膜之间有关系特别是Hp的三种粘附现象,我们提出Hp感染过程的假说如下。

第一步,Hp利用其特征性的菌体和鞭毛结构穿透不溶性粘液层,当Hp随食物进入胃中,首先伪造其鞭毛与胃粘膜表面的不溶性粘液层发生亲和性吸附。在不断运动着的胃壁上初步找到了一个落脚点。然后借其菌体的螺形结构,以及一端有数根象推进器样活泼运动的鞭毛使它在粘稠的不溶性液层中自由泳动。Venables报道,胃粘膜上的不溶性粘液层的化学结构是由二硫键连接的四个同等大小的亚单位组成的多聚体糖蛋白构成的。每一个亚单位以蛋白质为核心,四周围绕有碳水化合物的侧链,形似“瓶刷状”。 Hp利用其菌体及鞭毛结构上的特点可在这种平行排列的“瓶刷状”结构中作螺旋形的向前运动。

Hazell曾在模拟的粘稠环境中发现Hp比同样具有鞭毛的大肠杆菌的泳动速度快10倍。这就说明了在食物经过胃的短暂时间内,为何几乎只有Hp能透过不溶性粘液层,而其它细菌很难通过的重要原因。

第二,Hp依靠其菌体表面菌毛样网状结构稳定地定居于胃粘膜上皮细胞表面,Hp透过不溶性粘液层后首先仍然通过鞭毛在粘膜上皮表面“抛锚”。然后菌体迅速向粘膜上皮表面靠拢。伪造其菌体表面菌毛样网状结构(或称糖萼Glycocalyx)与胃粘膜上皮细胞表面紧密相连,达到比较稳定地固定在胃粘膜上皮的局部。这Hp特异性地只在胃粘膜组织或肠及食管胃化的组织上定居,而不在其他组织上定居的原因,可能在胃粘膜组织上存在有Hp的特异性受体之故。正由于它存在着特异性的较强的粘附机制,因此尽管不溶性粘液层和胃粘膜上皮以较快的速度不断代谢更新,一部分Hp随着表面的粘膜上皮和不溶性粘液层的更新而脱落,但总还是有一部分Hp在胃的不断运动中在就近的新生的粘膜表面或不溶性粘液层找到继续定居的场所。这就是造成人类的胃粘膜一旦被Hp感染后,Hp就较难以彻底消除的缘故,结果易形成持续感染的状态。这也是人胃的Hp感染率为何这么高的原因。

第三步,Hp部分细胞壁与胃粘膜上皮细胞直接相贴,依靠其脂多糖与细胞毒素等引起胃壁的病变,Hp的感染还不等于发病,只有在某种尚待探明的因素影响下,Hp菌体的部分细胞壁与胃粘膜上皮细胞直接相贴的第三种粘附机制过渡后,才由于细胞壁(这时Hp已失去包在菌体外面的一层外膜样结构)脂多糖的内毒素样作用引起局部粘膜样结构)脂多糖的内毒素样作用引起局部粘膜的炎症。另外,粘膜上皮表面大量Hp还可能由于所产生的强有力的尿素酶分解尿素后产生的氨离子阻挡H+从胃腺向胃腔通过。胃蛋白酶对粘液素的降解,细胞毒素对细胞的毒性作用等导致粘膜的溃疡。胃炎可能是溃疡的基础,反过来,溃疡又可能促进胃炎,因此慢性胃病中的胃炎和溃疡两种基本类型都与Hp感染的直接或间接作用密切相关。Hp在体外对许多抗生素是敏感的,但是由于种种原因真正能用于胃部疾病治疗的抗生素是有限的,即使有效的抗生素,由于不溶性粘液层的保护作用,亦很难将Hp彻底消灭干净。