幽门螺杆菌在双相培养基中生长的特性

幽门螺杆菌(Helicobacter Pylori, Hp)的发现被认为在人类胃炎病原学中具有重要的作用,此菌1982年首次发现,由Marshall等所描述并命名为Campylobacter Pyloridis,后来根据国际细菌命名规则(ICNB)改正为C.Pylori。1989年Goodwin等建议把Hp从弯曲菌属划出来,而成立一个新的属,称为幽门螺杆菌(HelicobacterPylori, Hp),目前已在国际性刊物和国际会议上应用此名称。幽门螺杆菌为微需氧菌,地氧较敏感,此菌营养要求高,在普遍蛋白胨水或肉汤中不能生长,在固体培养基上Goodwin(1985)推荐以脑一心浸液琼脂为基础,加入7%马血清,1%Isovitalix(BBL),万古霉素2mg/L,萘啶酮酸20mg/L,两性霉素2mg/L。该菌最适宜生长温度37°C,42°C条件下则不能生长,37°C下培养,细菌生长缓慢,培养3d~4d后在微氧条件下,固体培养基上可0.5mm~1mm直径灰白色透明的菌落,在血平皿上有时可见菌落周围有轻度溶血,该菌培养时要求温度高,尤其初代分离时,相对湿度至少要在98%以上,为此我们用布氏琼脂液体一固体双相培养基,对幽门螺杆菌的生长曲线进行了研究,现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 菌株 幽门螺杆菌89404株自北京市积水潭医院球溃疡病患者的胃粘膜中分离;菌株鉴定结果:氧化酶试验阳性,过氧化氢酶试验阳性。1%甘氨酸生长,马尿酸水解为阴性,37°C生长(+),25°C生长为(-)。在3.5%NaCl中不生长,对庆大霉素、四环素、痢特灵等敏感,对万古霉素抗药,在布氏血琼脂上生长良好,有轻微溶血。

1.2 液体—固体双相培养基的制备取25cm3组织培养瓶,高压来菌后加入6%脱纤维羊血布氏琼脂20ml,平放,待凝固后,将瓶子垂直,再加入新鲜配制的布氏肉汤9ml,置4°C冰箱内保存备用。

1.3 生长曲线的测定 将全羊备注中加89404的菌株自-70°C冷冻保存的幽门螺杆菌融化,取0.2ml菌液接种在6%布氏血琼脂平思虑中,于5%O2,10%CO2,85%N2的混合气体条件下于37°C培养3d后观察,选取新培养的Hp89404用10%小牛血清布氏肉汤(pH7.2)洗下,作1:10稀释,每个尝试各换1支吸管,再经充分混匀后,取10-4及10-5两管进行活菌计数,然后取10-4菌液1ml(10.15×102cfu/ml),直接接种在液体—固体双相培养基中,此时按0h培养的菌数计算,即在双相布氏血琼脂培养中,每毫升含菌液浓度为1.02×102/cfu/ml,然后将双相培养物置混合气体培养箱中,经不同时间(24h~144h)在布氏血琼脂平皿上进行活菌数测定。

1.4 pH值测定 将不同时间的菌株液取出,用精密pH试纸测定培养液的pH值,在测定前预备试验用数字式电pH样校正。

2 结果

2.1 幽门螺杆菌在固体培养基上生长特点

在固体布氏血琼脂平皿上,经37°C48h混合气体培养后,用10%小牛血清布氏汤洗下,菌液浓度掃标准比浊管18亿/ml菌配制,按10倍稀释法,取10-4管接种子固体布氏血琼脂上,经37°C72h培养后,菌落计数为1.02×102cfu/ml,同样以10-4接种在双上培养基则为1.14×104cfu/ml,而且在双相培养基上菌形弯曲较固体培养基上典型,球状菌体数量也较少。

2.2 Hp89404在双相培养基上的生长特点

为了解幽门螺杆菌生长特点,选择自胃病患者胃粘膜标本中分离的菌株(Hp89404),采用布氏琼脂双相培养基进行培养,于不同时间各取培养物进行活菌计数,同时还进行pH值测定,实验结果见表1。

表1 幽门螺杆菌(89404)在布氏血双相培养基上生长

生长时间 菌落计数(cfu/ml) PH值
1.02×102 7.2
24 2.50×102 6.9
48 4.97×102 6.9
72 1.14×104 6.8
96 1.24×105 6.6
120 2.87×105 6.6
144 9.75×104 6.4

从附表可见,幽门螺杆菌经培养0~24h,上潜伏期到缓慢生长期,在血双相培养基中,于37°C培养12h~20h开始出现浑浊,24h~48h以后,即可出现迅速对数生长期,并持续到120h,达到生长高峰,此时菌落数最高达2.87×105cfu/ml,以后随着培养时间的延长,菌落单位形成数则渐次下降,在144h时菌数为9.75104cfu/ml。从显微镜下观察菌体形态,培养24h~48h,见菌形呈较为典型的弯曲形、螺杆状或海鸥展翅样,到72h~96h为多形态性,有球状菌形出现。从液相培养液pH测定中24h~144h表明pH上原来7.2下降到6.4~6.9。

3 讨论

幽门螺杆菌的生长营养条件要求较高,胃粘膜培养物在固体培养基布氏血琼脂条件下,经37°C24h~48h微氧培养,细菌生长缓慢,在固体培养基上可见成睛集落细小 的灰白色透明的菌苔,初代培养经镜检形态为典型海鸥展翅样或S形弯曲菌,但经继代培养,特别是72h以后的培养物菌体常可变成多形态性,微球形则尤为多见,用双相培养物菌液均匀混浊,菌生长较快,保存时间相对也较长,这是否由于液体—固体双相培养基,其营养及温度均有利幽门螺杆菌的存活,有待进一步研究。